絲狀支原體山羊亞種腺苷磷酸化酶的提取與酶譜分析.pdf

1、近年來，支原體的耐藥現(xiàn)象己在各地出現(xiàn)，很多原米敏感的抗生素，不同程度的產(chǎn)生耐藥，久治不愈的病例屢見不鮮，盡管各地報道的結果不完全一致，但敏感率不斷下降的趨勢是相同的。肺炎支原體不侵入機體組織與血液，其致病首先通過頂端結構粘附在宿主細胞表面，并伸出微管插入胞內(nèi)吸取營養(yǎng)、損傷細胞膜，繼而釋放出神經(jīng)(外)毒素、磷酸酶、核酸酶、抗原、過氧化氫等代謝產(chǎn)物引起細胞的溶解、上皮細胞的腫脹與壞死，誘發(fā)機體產(chǎn)生的抗體也可能參與了上述病理損傷。據(jù)報道所有支

2、原體都會代謝產(chǎn)生腺苷磷酸化酶。綜上所述，支原體代謝產(chǎn)生的酶在支原體致病及分類鑒定方面起劍的作用有待研究。目前，對支原體代謝酶的研究國外報道很少，國內(nèi)沒有正式報道。 由絲狀支原體山羊亞種(即PG3株)所引起的山羊傳染性胸膜肺炎是山羊傳染病中最為流行的疾病之一，目前這種病仍廣泛發(fā)生在中亞、北非、中東等養(yǎng)羊聚集的國家和地區(qū)，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重危害。本實驗利川改良的Hartleys培養(yǎng)基，縮短山羊支原體的培養(yǎng)時間，通過對山羊支原體的培養(yǎng)觀

3、察，為進一步研究提供材料，同時增強對山羊支原體的認識，對腺苷磷酸化酶進行了初步研究，力求為支原體的致病機理的研究以及臨床鑒定診斷治療提供更多的理論依據(jù)。 1.腺苷磷酸化酶提取時間的確定 目的：確定在培養(yǎng)后的哪個時間段支原體代謝產(chǎn)生的腺苷磷酸化酶活性最高，為腺苷磷酸化酶的提取提供依據(jù)。方法：分別取PG3標準株和分離株48h培養(yǎng)液0.1ml接種于1 0ml的改良Hartleys液體培養(yǎng)基中，接種48管，37℃恒溫培養(yǎng)。每隔6

4、h取3管(2ml/管)，測定OD值和pH值，同時從3管中各取2ml測酶活。結果：山羊支原體在改良后的Hartleys培養(yǎng)基中生長適應期為0～1 8h，對數(shù)生長期為18～60h，穩(wěn)定期為60～72h，培養(yǎng)72h后進入衰亡期，在60h內(nèi)pH值下降較快，從pH7.5降到6.671，培養(yǎng)后第60h至第96h，pH值下降緩慢，保持在pH6.671～6.510；培養(yǎng)48h左右，酶活性最高。結論：把培養(yǎng)后48h作為腺苷磷酸化酶提取時間。 2.

5、腺苷磷酸化酶的提取純化 目的：為酶的特性研究作準備的同時檢測純化方法的可行性。方法：通過離心、超聲波裂解、鹽析、透析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等一系列蛋白質(zhì)分離純化方法對腺苷磷酸化酶進行分離純化，并用SDS-PAGE和總酶活、總蛋白含量、純化倍數(shù)等參數(shù)檢測純化效果。結果：腺苷磷酸化酶粗酶液SDS-PAGE分析結果顯示，腺苷磷酸化酶相對分子質(zhì)量約為29.1KDa，主要以胞內(nèi)可溶形式存在；純化倍數(shù)達117，純化所得

6、的腺苷磷酸化酶進行SDS-PAGE分析，結果顯示了一條分子量約為29.1kDa的單一條帶。結論：腺苷磷酸化酶得到很好的純化，也說明分離純化方法是可行的。 3.腺苷磷酸化酶酶學特性的研究 目的：了解腺苷磷酸化酶酶學特性，為更深入的研究提供理論依據(jù)。方法：配制pH分別為6.0、6.5、6.8、7.0、7.3、7.5和8.0的磷酸鉀緩沖液，測定不同pH時的酶活；測定反應溫度分別為30、34、37、40、45、50、55、60

7、、65和70℃時的酶活；以腺苷、肌營和尿苷為底物，研究腺苷磷酸化酶對不同底物的催化活性，反應體系中各底物的濃度均為1.5 mmol/l。結果：腺苷磷酸化酶有較好的熱穩(wěn)定性，37℃左右酶活力變化不大，最適反應溫度為50℃，當溫度高于55℃時，酶活力迅速下降；酶活的最適pH值為7.0，在堿性條件下，腺苷磷酸化酶的活力下降不大，但在酸性條件下，酶活下降很快，pH6.0時，酶活只有最適pH時的一半左右；腺苷磷酸化酶對腺苷顯示了最大的催化活性，而

8、肌苷是非常差的底物，對肌苷的酶比活是腺苷的5.6％，對尿苷幾乎沒有催化活性。結論：由培養(yǎng)液pH值變化測定知培養(yǎng)48h時的培養(yǎng)液pH值在7.0附近，而酶活的最適pH值為7.0，這證明把培養(yǎng)斤48h作為腺苷磷酸化酶提取時間是正確的。 4.腺苷磷酸化酶酶譜分析 目的：檢測此腺苷磷酸化酶是由幾種亞基構成，有無同工酶存在。方法：對腺苷磷酸化酶粗酶液進行SDS-PAGE(在分離膠中加入0.1％的腺苷)，電泳后，用25％的異丙醇使酶復