F10基因對A549細胞凋亡、化療敏感性及致瘤性的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 F10基因是本課題組在已完成的國家973課題研究過程中，采用抑制性消減雜交的方法，從葡萄胎與正常早孕絨毛的差異cDNA文庫中篩選出的一條功能未知新基因(GenBank登錄號AB196290)。由于該基因在消減雜交過程中，是將其保存在96孔板第F10孔的位置，故以F10暫時命名該基因。前期的研究表明，F(xiàn)10基因在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨痛中均呈陽性表達且依次增強，在卵巢腺癌、子宮內膜痛等婦科腫瘤中亦呈陽性表

2、達，但在正常子宮內膜和宮頸上皮組織中呈陰性表達?？梢?，F(xiàn)10基因可能是一種與葡萄胎的惡性變及婦科惡性腫瘤的發(fā)生有關的新基因。由于目前婦科惡性腫瘤仍是威脅廣大婦女健康的主要疾病，因此，F(xiàn)10基因作為一種與葡萄胎的惡性變及婦科腫瘤發(fā)生相關的新基因，其功能研究對于揭示此類腫痛的發(fā)病機制、指導臨床治療具有重要意義。
　　 目前最為常見的基因功能研究方法是基因轉導技術，而適宜的基因轉導載體對于基因的轉導效率和持續(xù)穩(wěn)定過表達起著關鍵作用。增

3、強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，在488nm激發(fā)波處，能形成鮮明的綠色熒光。在組織和細胞中，EGFP能耐受各種處理而保持其發(fā)光特性。
　　 本研究擬采用基因轉導技術，研究以下內容：(1)以F10基因低表達的A549細胞為細胞模型，以pEGFP-N1作為真核表達載體，構建穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞系；(2)在此基礎上，探討F1

4、0基因過表達對肺癌A549細胞凋亡的影響及機制；(3)選取紫杉醇為化療藥物，研究F10基因過表達對A549細胞化療藥物敏感性的影響；(4)將過表達F10基因的A549細胞接種裸鼠，觀察F10基因對A549細胞在裸鼠體內致瘤性的影響，并通過檢測與細胞凋亡密切相關的CASPASE-3、BAX和BCL-2的表達，進一步探討F10基因影響A549細胞致瘤性的作用機制。
　　 本課題屬原始創(chuàng)新性研究，通過研究葡萄胎高表達的F10基因對A5

5、49細胞凋亡、化療敏感性及致瘤性的影響，期望在F10基因功能的研究中有所突破，為將來發(fā)展基于F10基因的婦科腫瘤防治新措施提供理論支持。
　　 第一章 穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞株的建立及鑒定
　　 F10基因是一種功能未知的新基因，在肺癌A549細胞中呈現(xiàn)低表達。pEGFP-N1載體含有EGFP，可在488nm激發(fā)波處，形成鮮明的綠色熒光，標記基因的表達情況，并且具有復制力強、含高效強大啟動子和多克隆位點、含可

6、供G418篩選的新霉素耐藥標記的基因neo等特點，這些特殊結構使得它作為一種真核表達載體，能夠使目的基因在靶細胞內穩(wěn)定過表達?；谶@種理論，我們采用基因轉導技術，以pEGFP-N1為載體，將外源性F10基因導入A549細胞，期望建立一種穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞株，為進一步研究F10基因的生物學功能提供一個實驗平臺。
　　 研究方法
　　 設計并構建重組質粒pEGFP-N1-F10和pEGFP-N1-Mock，經

7、EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切、DNA測序鑒定正確后，轉染A549細胞株，經G418篩選，獲得陽性單克隆細胞株。利用熒光定量PCR技術鑒定陽性克隆。
　　 小結
　　 1.以pEGFP-N1為真核表達載體，設計并構建出pEGFP-N1-F10重組質粒，對pEGFP-N1-F10質粒進行酶切和測序，結果證實F10基因已成功連接至pEGFP-N1載體。
　　 2.以F10基因低表達的肺癌A549細胞為細胞模型，將pE

8、GFP-N1-F10質粒轉染A549細胞，經G418篩選，獲得陽性單克隆細胞。利用熒光定量PCR鑒定陽性克降，發(fā)現(xiàn)F10基因過表達組A549細胞中F10 mRNA的表達顯著高于陰性對照組A549細胞，提示穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞系成功構建，這為進一步研究F10基因的生物學功能提供了一個實驗平臺。
　　 第二章 F10基因過表達對A549細胞株凋亡的影響
　　 細胞凋亡受到多種基因調控，涉及多種酶的參與調節(jié)，其中

9、CASPASE-3和BAX是調控凋亡的兩個重要因子。而近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞凋亡受抑密切相關?；谶@些理論，我們利用已建立的穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞株，觀察F10基因過表達對肺癌A549細胞株凋亡的影響，并通過檢測與細胞凋亡密切相關的BAX和CASPASE-3的表達，探討F10基因影響A549細胞凋亡的機制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞株，并設F10+A

10、549細胞為實驗組，Mock-A549細胞為陰性對照組，A549-WT細胞為空白對照組。采用MTT檢測細胞體外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測細胞凋亡情況，RT-PCR檢測各組細胞BAX和CASPASE-3 mRNA表達，Western Blot檢測各組細胞BAX和CASPASE-3蛋白表達，并采用析因設計方差分析和單因素方差分析比較各組之間上述指標的變化。
　　 小結
　　 1.利用MTT檢

11、測細胞體外增殖能力，發(fā)現(xiàn)從12h開始，F(xiàn)10基因過表達組A549細胞較陰性對照組和空白對照組生長增快，提示F10基因促進A549細胞增殖。同時，采用TUNEL-FITC/Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)陰性對照組和空白對照組A549細胞中出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的細胞均明顯較F10基因過表達組多，提示F10基因過表達抑制A549細胞凋亡。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot檢測技術，發(fā)現(xiàn)F10基因過表達組A5

12、49細胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋白表達均低于陰性對照組和空白對照組，表明F10基因下調A549細胞中CASPASE-3和BAX表達，兩者參與了對凋亡的調控，提示F10基因過表達抑制A549細胞凋亡。
　　 第三章 F10基因過表達對A549細胞株紫杉醇化療敏感性的影響
　　 化療是治療惡性腫瘤的重要方法，傳統(tǒng)的腫瘤治療觀念是化療藥物直接作用于核酸、微管蛋白及其它靶點以殺傷腫瘤細胞；現(xiàn)在認識到化療藥物也可

13、以通過誘導細胞凋亡而殺傷腫瘤細胞。近年來發(fā)現(xiàn)紫杉醇(TAXOL)即是通過凋亡機理發(fā)揮抗腫瘤效應，在治療肺痛等腫痛中被廣泛應用。基于上述理論，我們以穩(wěn)定過表達F10基因的A549細胞株為平臺，選取紫杉醇為化療藥物，研究F10 基因過表達對化療藥物敏感性的影響，并通過檢測與細胞凋亡密切相關的CASPASE-3和BAX的表達，探討F10基因影響A549細胞化療敏感性的機制。
　　 研究方法
　　 利用已建立的穩(wěn)定過表達F10基

14、因的A549細胞株，并設F10+A549細胞為實驗組，Mock-A549細胞為陰性對照組，A549-WT細胞為空白對照組，分別給予紫杉醇處理。采用MTT檢測細胞體外增殖能力，TUNEL-FITC/Hoechst33258檢測細胞凋亡情況，RT-PCR檢測各組細胞BAX和CASPASE-3 mRNA表達，Western Blot檢測各組細胞BAX和CASPASE-3蛋白表達，并采用析因設計方差分析和單因素方差分析比較各組之間上述指標的變化

15、。
　　 小結
　　 1.利用MTT和TUNEL-FITC/Hoechst33258染色檢測技術，發(fā)現(xiàn)經紫杉醇處理后，陰性對照組和空白對照組A549細胞均較F10基因過表達組生長持續(xù)減慢，凋亡細胞增多，提示F10基因過表達抑制A549細胞對紫杉醇化療的敏感性。
　　 2.采用RT-PCR和Western Blot檢測技術，發(fā)現(xiàn)經紫杉醇處理后，F(xiàn)10基因過表達組A549細胞中BAX和CASPASE-3的mRNA和蛋

16、白表達均低于陰性對照組和空白對照組，表明F10基因下調紫杉醇處理后的A549細胞中CASPASE-3和BAX表達，提示F10基因可下調A549細胞中CASPASE-3和BAX表達，進而抑制其對紫杉醇的化療敏感性。
　　 第四章 F10 基因過表達對A549細胞株致瘤性的影響
　　 自課題組發(fā)現(xiàn)F10基因以來，我們前期的工作主要集中于細胞水平上的研究，而裸鼠成瘤實驗則可以模擬人體內環(huán)境，在動物活體上觀察F10基因對腫瘤細胞

17、致瘤性的影響。因此，我們將前期建立的穩(wěn)定過表達F10基因的肺癌A549細胞株接種裸鼠，觀察F10基因對A549細胞在裸鼠體內致瘤性的影響，并探討其機制。
　　 研究方法
　　 利用已構建的過表達F10基因的A549細胞株，制備裸鼠肺癌動物模型，致瘤小鼠隨機分為A549-WT、Mock-A549和F10+A549三組。通過裸鼠成瘤實驗來確定F10基因對肺癌A549細胞在裸鼠體內致瘤性的影響，應用免疫組化檢測成瘤組織中CAS

18、PASE-3、BAX和BCL-2的蛋白表達，并采用單因素方差分析和重復測量方差分析比較各組之間上述指標的變化。
　　 小結
　　 將穩(wěn)定過表達F10基因的肺癌A549細胞株接種裸鼠，發(fā)現(xiàn)F10基因過表達組A549細胞接種后的腫瘤，其成瘤時間縮短、瘤體積增加，腫瘤生長速度加快，免疫組化檢測顯示出相對于對照組較低的CASPASE-3和BAX表達水平以及較高的BCL－2表達水平。提示F10基因通過下調CASPASE-3和BAX