基于基因表達(dá)譜芯片技術(shù)的天然羥基磷灰石成骨誘導(dǎo)機(jī)理研究.pdf

1、羥基磷灰石（HA）是臨床常用的骨缺損修復(fù)材料之一，被認(rèn)為具有良好的生物相容性和較好的成骨誘導(dǎo)性能。作為哺乳動(dòng)物骨骼和牙齒的主要無機(jī)成分，羥基磷灰石在自然界中廣泛存在。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者以豬骨、牛骨、珊瑚等為原料制備天然羥基磷灰石，并采用不同的實(shí)驗(yàn)方法分別從整體水平、細(xì)胞水平和分子水平等證實(shí)了天然HA具有較好的成骨誘導(dǎo)性能。然而，對(duì)羥基磷灰石，尤其是天然羥基磷灰石，成骨誘導(dǎo)機(jī)理的研究都較少。從基因表達(dá)的水平深入理解HA的成骨誘導(dǎo)機(jī)理不僅可以更好

2、地理解HA的生物學(xué)性能，對(duì)于骨修復(fù)材料的開發(fā)和應(yīng)用也具有十分重要的意義。
　　 本論文的研究目的是在天然羥基磷灰石與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）相互作用的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析相結(jié)合的方法，從分子水平分析研究天然羥基磷灰石的成骨誘導(dǎo)機(jī)理。
　　 本論文的具體工作如下：
　　 1.采用高溫煅燒法從豬骨中提取了天然羥基磷灰石，并用粉末壓片和高溫?zé)Y(jié)的方法將其壓制成直徑為2cm和10

3、cm的圓盤狀樣品。通過紅外光譜表征，證明煅燒提取和壓片后的樣品成分僅為羥基磷灰石；掃描電鏡觀察顯示，天然HA樣品表面疏松有孔。
　　 2.建立小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)的方法，并采用MTT法測(cè)定其細(xì)胞活力代謝標(biāo)準(zhǔn)曲線。將MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于天然HA與小鼠MSCs相互作用檢測(cè)，考察了材料表面生長(zhǎng)不同時(shí)間（24h、48h和72h）的小鼠MSCs細(xì)胞增殖情況以及材料對(duì)細(xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天然HA對(duì)小鼠MSCs

4、分化的促進(jìn)導(dǎo)致了增殖率的下降，而對(duì)其細(xì)胞周期無明顯影響。
　　 3.通過基因表達(dá)譜芯片技術(shù)獲得與天然HA作用24h、48h和72h的小鼠MSCs基因表達(dá)譜，篩選得到3個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生過差異表達(dá)的基因共8992個(gè)。根據(jù)基因的功能和差異表達(dá)情況，選擇8個(gè)與MSCs成骨分化密切相關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)天然HA對(duì)小鼠MSCs成骨分化相關(guān)基因的影響。
　　 4.應(yīng)用Cluster

5、&TreeView軟件、DAVID在線程序和GoSurfer軟件對(duì)全部8992個(gè)差異表達(dá)基因分別進(jìn)行層次聚類和GO功能分類分析。聚類結(jié)果顯示，與材料作用48h和72h的實(shí)驗(yàn)組基因差異表達(dá)情況相似性較高。聚類分析將全部差異表達(dá)基因分成4個(gè)特征明顯的聚類簇，GO分析表明各簇基因在功能上也表現(xiàn)出顯著的差異，說明不同功能的基因在不同的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生差異表達(dá)。從生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分三個(gè)方面對(duì)8992個(gè)差異表達(dá)基因的GO功能分類分析發(fā)現(xiàn)，差異

6、表達(dá)基因集中分布在某幾個(gè)功能節(jié)點(diǎn)，如第二層次的細(xì)胞過程和生物過程的調(diào)控；結(jié)合和催化活性；細(xì)胞和細(xì)胞器等。
　　 5.根據(jù)基因的GO功能分類，在8992個(gè)差異表達(dá)基因中篩選得到了90個(gè)與成骨分化相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過文獻(xiàn)查閱與比較，發(fā)現(xiàn)篩選出的基因中不僅包含MSCs成骨分化過程中的標(biāo)志性基因，還有一些在生物材料與骨細(xì)胞相互作用中發(fā)生差異表達(dá)的基因，除此之外，本論文也得到了一些在生物材料與MSCs相互作用中首次發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因，

7、如Kruppel樣因子10（K1f10）、齒狀蛋白1（Jagl）等。分別采用Cluster&TreeView軟件、DAVID在線程序、GoSurfer軟件、GenMAPP軟件包和IPA分析平臺(tái)對(duì)這90個(gè)與成骨分化相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。層次聚類和GO功能分類分析結(jié)果表明，上調(diào)表達(dá)基因占優(yōu)勢(shì)，且基因與骨礦化、骨重建、成骨、成骨細(xì)胞分化等功能關(guān)系密切；分子功能主要涉及酶活性的調(diào)節(jié)，參與基因的表達(dá)調(diào)控；大多數(shù)基因作用的區(qū)