豬瘟病毒石門株E2基因在永生化豬血管內(nèi)皮細胞的表達.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的豬的急性高度接觸性傳染病，嚴重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定必須報告的傳染病。CSFV為有囊膜的RNA病毒，病毒基因組僅有一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼E0(或Ems)、E1和E2 3種囊膜糖蛋白，其中E2基因是豬瘟病毒的主要保護性抗原，可以有效刺激機體產(chǎn)生中和抗

2、體，抵抗CSFV強毒株的攻擊。由于傳統(tǒng)弱毒活疫苗接種后無法在血清學診斷上與自然感染強毒株相區(qū)別，弱毒活苗還能通過母體胎盤的感染造成死胎、弱仔、先天性感染仔豬，導致免疫耐受，而基因工程疫苗的出現(xiàn)為這一問題的解決提供了新的思路。因此，本試驗選取E2基因在逆轉(zhuǎn)錄病毒的介導下轉(zhuǎn)染永生化豬臍血管內(nèi)皮細胞(swine umbilical vein endothelialcells，SUVECs)，并表達在該細胞膜上，初步構(gòu)建基因工程疫苗。且本試驗所

3、選用的永生化豬臍血管內(nèi)皮細胞為一種生理狀態(tài)下的細胞系，不具有致瘤性，不存在生物安全方面的問題，這在研究和開發(fā)豬瘟基因工程細胞苗方面具有相當大的潛力。本試驗獲得了以下結(jié)果： 1.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-E2的構(gòu)建。RT-PCR擴增豬瘟病毒石門株E2基因，將其連接到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro中，經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定，證明E2基因成功插入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro中，重組載體構(gòu)建成功。聚乙二醇

4、法提取和純化質(zhì)粒，以備包裝假病毒用。 2.假病毒的包裝。構(gòu)建好的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-E2與pVSV-G質(zhì)粒經(jīng)磷酸鈣共轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)入293GP細胞中包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒假病毒，36～48h后收取上清，分裝備用。 3.表達E2基因陽性細胞的篩選和初步免疫試驗。包裝好的假病毒轉(zhuǎn)入永生化豬臍血管內(nèi)皮細胞，嘌呤霉素篩選出陽性細胞，對篩選出的陽性細胞進行流式細胞分析和分選；經(jīng)間接免疫熒光染色試驗和RT-PCR鑒定，豬瘟