腺病毒介導OX40Ig基因轉移在誘導大鼠肝臟移植物長期存活中的作用和機制研究.pdf

1、目的: (1)改良二袖套法大鼠原位肝臟移植動物模型的成功建立。 (2)改良二袖套法大鼠原位肝臟移植急性排斥動物模型的建立。 (3)重組腺病毒pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-OX40Ig(AdOX40Ig)的構建 (4)研究重組腺病毒AdOX40Ig不同感染劑量對人肝細胞HL-7702生長的影響及其感染效率，篩選最佳感染劑量進行該重組腺病毒的生物學功能研究。 (5)探討腺病毒介導OX4

2、0Ig基因轉移在誘導大鼠肝臟移植物長期存活中的作用和機制。 方法: (1)通過改良的雙袖套法對130對SD大鼠進行了原位肝移植。前面40對為預試驗組，中間60對為實驗熟練組，后面30對為實驗完善組。觀察各組的手術成功率和術后生存率以及手術并發(fā)癥。 (2)采用改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝臟移植共30例，將其隨機分成實驗組15例，術后未進行特殊的干預，和對照組15例，術后1

3、～7天用FK5060.2mg/(kg.d)灌胃。術后4、7和10天的時間點上各組均隨機處死3只受體大鼠，收集血清與肝臟標本，其余受體大鼠的血清標本通過舌靜脈取血獲得。血清標本檢測細胞因子和生化指標，肝臟標本觀察病理變化和肝細胞凋亡。每組各留6只觀察術后生存情況及生存時間。 (3)將經過雙酶切的hOX40片段和hIgG1 Fc片段與同樣經過雙酶切的pAdTrack-CMV載體進行連接反應，并在大腸桿菌感受態(tài)細胞里轉化成pAdTra

4、ck-CMV-hOX40Ig轉移質粒，再通過PCR擴增雙酶切及DNA測序鑒定，經鑒定正確的質粒命名為pAdTrack-CMV-OX40Ig(pTOX40Ig)。 將pTOX40Ig轉移質粒經Pme I單酶切線性化后，與pAdeasy-1腺病毒載體氯化鈣法共轉化BJ5183感受態(tài)細胞，涂布卡那平板，挑選克隆、擴增，抽提質粒行PER及Pac I酶切鑒定。 鑒定正確的重組腺病毒質粒pAdOX40Ig經Pac I酶切后，采用Li

5、pofectamine2000脂質體轉染法轉染293A細胞，轉染第3天在熒光顯微鏡下觀察熒光。重組腺病毒AdOX40Ig通過Western印跡鑒定。 (4)將AdvOX40Ig重組腺病毒以1、10、25、50、100、200MOI不同劑量感染HL-7702細胞。在普通光鏡視野下觀察被感染后HL-7702細胞形態(tài)，在熒光視野下觀察綠色熒光。 將AdvOX40Ig重組腺病毒和Ad空載體腺病毒以50MOI劑量分別感染爬片的HL

6、-7702細胞，用免疫熒光染色試劑盒進行間接免疫熒光檢測腺病毒介導的外源性OX40Ig基因在HL-7702細胞中的表達；用ELISA法測定轉染AdvOX40Ig的HL-7702肝細胞培養(yǎng)上清。 (5)改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway(BN)大鼠原位肝臟移植40例，隨機分成4組，每組10對。對照組：供、受體均未經任何處理，空載病毒AdEGFP處理組：術中供肝離體后肝內留存2ml的AdEGFP腺病毒[1×109

7、pfu/ml]，AdOX40Ig處理組：術中供肝離體后肝內留存2ml的AdOX40Ig腺病毒[1×109pfu/ml]，F(xiàn)K506處理組：術后FK506(0.2mg·kg-1·d-1)灌胃。 術后第7天每組各處死BN鼠3只，先經下腔靜脈抽血，取部分血清，進行肝功能的檢測，取肝臟，觀察病理變化和肝細胞凋亡，取脾臟細胞與Lewis大鼠和第三品系F344大鼠的脾臟細胞進行單向混合淋巴細胞反應(MLR)。在BN大鼠與Lewis大鼠的ML

8、R反應體系中，另取3個復孔，在每個復孔中加入20μl(1 IU/μl)重組IL-2。取四組處死BN大鼠的剩余血清及術前舌靜脈采血取得的血清，采用雙抗體夾心ABE-ELISA法來檢測IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量。余大鼠觀察生存期，并且分別于病毒給予當天和第1、3、7、10、14、21和28天取大鼠尾靜脈血，收集血清。用ELISA法檢測血清中OX40Ig蛋白表達水平。結果 (1)預試驗組的手術成功率和7天生存率分

9、別為27.5％和0；實驗熟練組分別為75.0％和40.0％；實驗完善組分別為93.3％和86.7％。 (2)手術的成功率是93.7％(30/32)。實驗組大鼠在術后7～10天表現(xiàn)出明顯的急性排斥癥狀。實驗組的生存時間是9.17±1.17(天)，而對照組是50.17±8.50(天)。實驗組的肝功能(AST、ALT、TB)明顯高于對照組。實驗組術后第7天的血清IFN-γ和IL-2濃度明顯高于術前，而IL-4和IL-10濃度則明顯低于

10、術前；對照組正好與此相反，術后第7天的血清IFN-γ和IL-2濃度明顯低于術前，而IL-4和IL-10濃度明顯高于術前。受體大鼠術后肝臟病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，實驗組術后第7天出現(xiàn)中度細胞性排斥，10天出現(xiàn)重度細胞性排斥，而對照組術后第7和第10天呈輕微細胞性排斥。此外，實驗組肝細胞凋亡數較對照組顯著增多。 (3)經酶切反應及DNA測序鑒定，重組腺病毒質粒pAdOX40Ig序列正確。重組腺病毒質粒pAdOX401g轉染293A細胞，

11、轉染第3天在熒光顯微鏡下能觀察到熒光。反復凍融的重組病毒子經多輪感染后，檢測效價達到1010pfu/ml。重組腺病毒AdOX40Ig的Western印跡鑒定可以看到48.7kD的條帶。 (4)在普通光鏡視野下觀察1、10、25、50、100MOI不同劑量重組腺病毒感染組HL-7702細胞均形態(tài)正常，生長良好；而200MOI劑量感染組細胞圓縮、脫落，呈現(xiàn)明顯的細胞毒性；在熒光視野下，10、25、50、100、200MOI不同劑量重

12、組腺病毒感染組HL-7702細胞幾乎所有細胞均可觀察到綠色熒光。 AdvOX40Ig感染組HL-7702細胞能檢測到Cy3紅色熒光，而Ad空病毒感染組和未感染組HL-7702細胞則未出現(xiàn)紅色熒光。ELISA測定顯示，AdOX40Ig感染組細胞培養(yǎng)上清中OX40Ig濃度明顯高于無病毒感染組和AdEGFP感染組。 (5)AdOX40Ig處理組和FK506處理組受體大鼠存活時間明顯超過對照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝功

13、能(AST、ALT、TB)明顯低于對照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝細胞性排斥明顯低于對照組和空載病毒AdEGFP處理組，肝細胞凋亡也明顯少于對照組和空載病毒AdEGFP處理組。術后AdOX40Ig處理組和FK506處理組受體大鼠血清中IFN-γ、IL-2的含量較術前明顯降低，而IL-4和IL-10的含量則較術前明顯升高；對照組和空載病毒AdEGFP處理組大鼠肝移植術后排斥組血清中IFN-γ、IL-2的含量較術前明顯升高，而IL-4

14、和IL-10的含量較術前明顯降低。AdOX40Ig處理組和FK506處理組的CPM值均明顯高于對照組和空載病毒AdEGFP處理組。在BN大鼠與Lewis大鼠的MLR反應體系中，加入重組IL-2，Ad0X40Ig處理組和FK506處理組CPM值下降輕，與未加入重組IL-2的CPM值相比，差異有統(tǒng)計學意義。在BN大鼠與F344大鼠的MLR反應體系中，CPM值結果顯示對照組、空載病毒AdEGFP處理組和Ad0X40Ig處理組相互之間無統(tǒng)計學意

15、義上的差異，但是這三組的CPM值均明顯高于FK506處理組。 結論: (1)熟練和完善的外科操作技術是手術成功的關鍵；縮短無肝期時間是術后長期生存的有效保障。 (2)以近交系Lewis大鼠為供體、BN大鼠為受體的組合發(fā)生的急性排斥反應強烈而且穩(wěn)定，是理想的大鼠肝臟移植急性排斥模型。 (3)重組腺病毒pAdOX40Ig構建成功，檢測效價達到1010pfu/ml。 (4)結果表明10、25、50、10

16、0MOI不同劑量病毒感染HL-7702細胞對細胞幾乎無毒性，而且呈很高的感染效率，其可達90％以上，這提示10MOI為最佳感染劑量。間接免疫熒光檢測結果和ELISA法測定結果均表明，腺病毒介導的外源性OX40基因能在HL-7702細胞中成功表達。 (5)用OX40Ig處理供肝具有FK506的抗急性排斥反應的功能，具體表現(xiàn)在，用AdOX40Ig處理的大鼠存活時間長，肝細胞性排斥輕，肝細胞凋亡少，肝功能損害輕，免疫反應向Th2細胞偏