RNA干擾抑制BMP-2基因表達對肝癌SMMC7721細胞增殖和侵襲的影響及機制.pdf

1、siRNA抑制BMP-2基因表達對肝癌SMMC7721細胞增殖和侵襲的影響及機制
　　 第一部分、肝癌SMMC7721細胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體表達的研究
　　 目的:檢測細胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、3、4、5、6、7(BMP-2、3、4、5、6、7)及其Ⅰ型受體(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受體(BMPR-II)在肝癌SMMC7721細胞中的表達。
　　 方法：采用RT-PCR檢測在肝癌SMMC7721細胞

2、中BMP-2、3、4、5、6、7及其Ⅰ型受體(BMPR-IA、BMPR-IB)和Ⅱ型受體(BMPR-II)mRNA水平的表達。采用Western blot檢測BMP-2、6及BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-II在正常肝細胞和肝癌SMMC7721細胞中蛋白水平表達的差異。
　　 結(jié)果:1、RT-PCR檢測結(jié)果顯示在人肝癌SMMC7721細胞中,BMP-2基因呈高表達、BMP-6基因呈中等程度表達(相對光密度比值ROD分別

3、為0.81±0.12、0.52±0.13),而BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-7基因僅見微量表達,BMPs受體BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-II均見不同程度表達(ROD分別為0.62±0.11、0.73±0.19、0.79±0.22):2、Western blot檢測結(jié)果提示正常肝細胞能表達BMP-2、BMP-6,但其表達量明顯低于肝癌SMMC7721細胞,二者相比較差異有非常顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);3、

4、Western blot檢測結(jié)果提示,肝癌SMMC7721細胞能表達BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-II,且其表達量與正常肝細胞相比無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:1、人肝癌SMMC7721細胞中,BMP-2基因呈高表達、BMP-6基因及BMPR-IA、BMPR-IB、BMPR-II呈中等程度表達。2、BMP-2、BMP-6在肝癌SMMC7721細胞中表達量明顯高于正常肝細胞,BMPR-IA、BMPR-IB、

5、BMPR-II在肝癌SMMC7721細胞表達量與正常肝細胞相仿。
　　 第二部分、BMP-2在原發(fā)性肝癌組織中的表達及其臨床意義
　　 目的：研究BMP-2基因在原發(fā)性肝癌及正常肝組織中的表達,結(jié)合原發(fā)性肝癌的臨床病理因素,探討B(tài)MP-2基因與原發(fā)性肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　 方法:1、采用RT-PCR方法檢測BMP-2基因在30例肝癌組織和10例正常肝臟組織中mRNA水平的表達。2、采用RT-PCR、W

6、estern blot檢測BMP-2基因在不同臨床病理參數(shù)的肝癌組織中的mRNA和蛋白表達水平,并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：BMP-2基因在肝癌組織中呈高表達,而在正常肝組織的表達則明顯減弱(P＜0.01),BMP-2的表達與臨床分期、病理分級、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.01);而與患者年齡、病理分型、AFP以及是否合并肝硬化等因素無明顯相關(guān)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：BMP-2在原發(fā)性肝癌中的表

7、達顯著高于相應(yīng)的正常肝組織中的表達,提示BMP-2的表達是原發(fā)性肝癌的重要特征,BMP-2的表達與原發(fā)性肝癌的惡性生物學行為密切相關(guān)。
　　 第三部分、siRNA抑制肝癌SMMC7721細胞BMP-2基因表達的研究
　　 目的:探討siRNA干擾對肝癌SMMC7721細胞BMP-2基因表達的影響。
　　 方法：設(shè)計并合成針對BMP-2的3個siRNA分子序列。分為6組:Ⅰ組為正常對照組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞);Ⅱ組為空

8、白對照組(只轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體,無特異性siRNA);Ⅲ組為陰性對照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA);Ⅳ～Ⅵ組為轉(zhuǎn)染組(分別轉(zhuǎn)染BMP-2-siRNA-A、BMP-2-siRNA-B及BMP-2-siRNA-C)。陽離子脂質(zhì)體法瞬間轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞,應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測細胞中BMP-2在mRNA水平和蛋白水平的變化。
　　 結(jié)果：正常對照組、空白對照組、陰性對照組以及BMP-2-siRNA-A轉(zhuǎn)染組、BMP

9、-2-siRNA-B轉(zhuǎn)染組、BMP-2-siRNA-C轉(zhuǎn)染組條帶經(jīng)光密度測定、計算相對光密度比值ROD分別為0.89±0.11、0.93±0.12、0.92±0.14、0.65±0.08、0.32±0.07、0.55±0.07,各組進行比較,可見3個轉(zhuǎn)染組細胞BMP-2表達均明顯低于其他對照組(P＜0.05)。其中,BMP-2-siRNA-B轉(zhuǎn)染組干擾效果最好,mRNA表達最低,其表達的相對值由(0.92±0.14)降至(0.32±0.

10、07)(P＜0.01),而正常對照組、空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),BMP-2-siRNA-A轉(zhuǎn)染組、BMP-2-siRNA-B轉(zhuǎn)染組、BMP-2-siRNA-C轉(zhuǎn)染組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,BMP-2-siRNA-B組轉(zhuǎn)染后干擾效果最好,BMP-2蛋白表達量的相對灰度值RGS明顯下調(diào)(0.37±0.10),與BMP-2-siRNA-A,BMP-2-siRNA

11、-C組相比較,差異有顯著意義(P＜0.05),而正常對照組、空白對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義。Western blot檢測結(jié)果與RT-PCR一致。
　　 結(jié)論：siRNA-BMP-2能明顯抑制肝癌細胞SMMC7721的BMP-2表達,以BMP-2-siRNA-B作用最為顯著。
　　 第四部分、siRNA抑制BMP-2表達對肝癌SMMC7721細胞體外增殖和侵襲的影響
　　 目的:探討siRNA抑制BMP-

12、2表達對肝癌SMMC7721細胞體外增殖和侵襲的影響。
　　 方法：本研究共分三組:1、空白對照組(SMMC7721-nontransfection,細胞不加轉(zhuǎn)染試劑);2、陰性對照組(SMMC7721-siControl，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA);3、實驗組(SMMIC7721-siBMP-2,轉(zhuǎn)染BMP-2 siRNA)。用MTT檢測、流式細胞儀、平板黏附模型、劃痕“愈合”模型以及Matrigel體外侵襲實驗等方法觀察三組細

13、胞增殖、凋亡以及黏附、遷移、侵襲能力的改變。
　　 結(jié)果:1、MTT法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24小時后,SMMC7721-siBMP-2組SMMC7721細胞增殖水平與空白對照組和陰性對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),而48小時及72小時后SMMC7721細胞增殖水平明顯降低。(P＜0.05)。流式細胞儀分析siBMP-2轉(zhuǎn)染48小時后,SMMC7721-siBMP-2組G0/G1期細胞(59.30％)較空白對照組(32.35％

14、)和陰性對照組(31.08％)細胞明顯增加(P＜0.05);S期細胞(22.39％)較空白對照組(35.51％)和陰性對照組(38.32％)細胞明顯減少(P＜0.05),細胞凋亡率(16.5％)較空白對照組(1.75％)和陰性對照組(1.49％)細胞明顯增加(P＜0.01)。2、平板黏附模型實驗提示SMMC7721-siBMP-2組細胞黏附能力較其它兩組明顯降低(P＜0.01)。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示細胞劃痕寬度分別為SEdC7721-s

15、iBMP-2組65.8±5.3μm,空白對照組36.64±4.0μm,陰性對照組34.1±5.1μm,提示SMMC7721-siBMP-2組細胞遷移能力顯著降低,其細胞劃痕寬度與其它兩組相比較,差異有顯著意義(P＜0.01)。Matrigel體外侵襲實驗(transwell侵襲小室模型)結(jié)果顯示SMMC7721-siBMP-2組、空白對照組和陰性對照組細胞穿膜數(shù)分別為11.5±2.0、33.5±3.1和35.7±3.4,提不BMP-2-

16、siRNA沉默BMP-2基因后,肝癌SMMC7721細胞的穿膜數(shù)明顯降低,即細胞侵襲能力明顯降低,與空白對照組、陰性對照組細胞比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：通過siRNA抑制BMP-2基因的表達,在體外可以顯著抑制肝癌SMMC7721細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。
　　 第五部分、siRNA抑制BMP-2表達對肝癌SMMC7721細胞增殖和侵襲影響的機制
　　 目的:探討siRNA抑制B

17、MP-2表達對肝癌SMMC7721細胞體外增殖和侵襲影響的機制。
　　 方法：用BMP-2-siRNA轉(zhuǎn)染肝癌SMMC7721細胞48h后,用Western blot檢測p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表達水平;分別用RT-PCR、Western blot及明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9、E-Cad以及uPA的表達水平及活性。
　　 結(jié)果：RT-PCR和Western blot顯示BMP-2-siRNA轉(zhuǎn)染肝

18、癌SMMC7721細胞48之后,p-ERK蛋白表達水平明顯降低,p-JNK、p-p38蛋白表達水平無明顯變化。MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào),明膠酶譜分析顯示細胞分泌活性形式的MMP-2、MMP-9也明顯減少。E-CadmRNA和蛋白表達均明顯上調(diào),而uPAmRNA和蛋白表達則無明顯變化。
　　 結(jié)論：BMP-2-siRNA抑制肝癌SMMC7721細胞增殖和侵襲能力可能是通過MAPK/ERK信號傳導(dǎo)通路下調(diào)