血管緊張素Ⅱ?qū)w外培養(yǎng)人牙髓細胞生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、目的:通過組織塊酶消化法進行人牙髓細胞的原代培養(yǎng)以獲得大量可供實驗用的牙髓細胞，建立人牙髓細胞的體外研究模型。研究不同濃度的AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)人牙髓細胞增殖效應、細胞周期進程、遷移等一系列生物學活性的影響。
　　方怯:
　　1.選取符合納入標準的新鮮拔除健康牙（均經(jīng)患者知情同意），在無菌條件下拔出牙髓組織，通過組織塊酶消化法進行牙髓細胞的原代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察組織塊的解離情況，細胞的形態(tài)學表現(xiàn)和生長狀態(tài)，待細胞生長融合達80

2、％鋪滿瓶底后，用0.25％胰酶消化按1∶1進行細胞首次傳代，以后傳代按1∶3比例進行，取生長狀況良好的第4代人牙髓細胞，胰酶消化后制備成細胞懸液進行細胞爬片，用SABC法進行波形蛋白和角蛋白免疫組化染色鑒定細胞來源。HE染色觀察細胞的組織學形態(tài)。
　　2.取生長狀態(tài)良好的第4代人牙髓細胞，0.25％胰酶消化，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度為2×104個/ml，接種于96孔板，每孔加液量200μL。隨

3、機分為五個實驗組和一個對照組，每組復五孔。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍。在相應實驗組的孔內(nèi)加入200μL含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制的AngⅡ溶液(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)，對照組加入等量的含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于24h、48h、72h各取出一塊96孔板，加入CCK-8溶液，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)

4、孵育2h，酶標儀上450nm波長處測各孔吸光度值（OD值）。
　　3.取生長狀態(tài)良好的第4代人牙髓細胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，1000r/min離心5min，棄上清液，加完全培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度為2×104個/ml，接種在25ml的培養(yǎng)瓶中，每瓶加液量3ml。隨機分為兩組，每組復三瓶，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄瓶內(nèi)原培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍，實驗組相應的瓶內(nèi)加入3ml含5％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液配制的10-7

5、mol/L AngⅡ溶液，對照組加入等量含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)牙髓細胞48h，消化，離心，收集細胞，加入-20℃預冷70％的乙醇，4℃過夜固定樣本，按照細胞周期試劑盒說明書操作，應用流式細胞儀檢測分析AngⅡ?qū)ρ浪杓毎腄NA合成，細胞周期進程的影響。
　　4.Transwell遷移實驗。取生長良好的第4代人牙髓細胞，0.25％胰蛋白酶消化，1000r/min離心5min，棄上清液，用完全培養(yǎng)液重懸細胞制備成濃度為

6、1×106個/ml的細胞懸液，以每孔100μL加液量接種于Transwell小室的上室內(nèi)。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察到細胞貼壁狀態(tài)良好后，換用含1％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牙髓細胞24h進行細胞周期同步化處理，棄原孔內(nèi)培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液沖洗，隨機分為五個實驗組和一個對照組。實驗組及對照組所有孔的上室內(nèi)均加入100μL不含血清的DMEM培養(yǎng)液，實驗組下室內(nèi)加入600μL DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度（10-9mol/L、

7、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）的AngⅡ溶液，對照組下室內(nèi)加入等量DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。顯微鏡下觀察細胞生長狀況，下室內(nèi)有無牙髓細胞。用眼科鑷取出Transwell小室，棉簽輕輕拭去小室濾膜內(nèi)表面的牙髓細胞，37℃ PBS浸洗，70％酒精固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)各組的穿膜細胞數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.通過組織塊酶消化法進行牙髓細胞的原代培養(yǎng)所獲得的細胞形

8、態(tài)均一為典型的梭性，胞體豐滿，胞漿豐富，圓形或橢圓形的細胞核位于細胞中央。免疫組織化學染色結(jié)果示波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。符合牙髓細胞組織學表現(xiàn)。
　　2.與對照組相比，一定濃度范圍內(nèi)（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促進體外培養(yǎng)的人牙髓細胞的增殖效應。且在這一濃度范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)ρ浪杓毎拇僭鲋匙饔贸尸F(xiàn)濃度依賴性。與對照組相比，AngⅡ可促進細胞DNA合成，推進牙髓細胞的細胞

9、周期進程(P＜0.05)。
　　3.與對照組相比，在一定濃度范圍內(nèi)（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促進體外培養(yǎng)的人牙髓細胞的遷移作用。且在該濃度范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)ρ浪杓毎拇龠w移作用呈濃度依賴性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用組織塊酶消化法可成功培養(yǎng)出牙髓細胞，培養(yǎng)所得的細胞形態(tài)學表現(xiàn)，組織來源鑒定結(jié)果等均符合人牙髓細胞生物學特性。
　　2.一定濃度范圍內(nèi)，