鴨瘟病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其強(qiáng)弱毒株UL2基因差異分析.pdf

1、鴨瘟又稱鴨病毒性腸炎，是由鴨腸炎病毒引起的常見(jiàn)于鴨、鵝及其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性、高度接觸性傳染病。該病是一種泛嗜性感染的疾病，感染后發(fā)病率及死亡率都很高，給我國(guó)的水禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。鴨瘟病毒基因組龐大，雖然GenBank中已經(jīng)發(fā)表了幾個(gè)毒株的全基因組序列，但針對(duì)各基因的相關(guān)研究分析依然很少。
　　本試驗(yàn)從山東高青某鴨場(chǎng)的發(fā)病鴨中分離到一株病毒，經(jīng)PCR鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)確定

2、為鴨瘟病毒。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的DEV基因組序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)擴(kuò)增UL2基因的特異性引物，分別提取該DEV高青分離株和實(shí)驗(yàn)室保存的另一DEV強(qiáng)毒泰安株的基因組DNA后，對(duì)UL2基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定，并與GenBank中已發(fā)表的鴨瘟病毒序列進(jìn)行比較。序列分析結(jié)果顯示，這兩個(gè)毒株的UL2基因都與已發(fā)表的DEV強(qiáng)毒序列有相同的特征，而與中國(guó)疫苗株VAC株和Clone-03株等弱毒株存在較大的差異，弱毒株的UL2基因都缺失了

3、一個(gè)528bp的大片段。這表明該DEV高青分離株具有強(qiáng)毒株的基因型特征，提示弱毒株中UL2基因所發(fā)生的大片段缺失很可能與病毒的毒力減弱直接相關(guān)。
　　之后我們選取鴨瘟病毒相對(duì)保守的UL44基因序列，利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)合成一對(duì)熒光定量PCR引物，并對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增、克隆，構(gòu)建出鴨瘟病毒目的基因的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，成功建立了檢測(cè)DEV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法。該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.7×101個(gè)拷貝，