表達(dá)密碼子優(yōu)化犬細(xì)小病同毒VP2蛋白重組犬瘟熱弱毒疫苗株的構(gòu)建.pdf

1、犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的傳染犬科動(dòng)物的，高度接觸性、致死性疾病，以出血性腸炎和亞急性心肌炎為特征。犬細(xì)小病毒病主要通過糞-口途徑傳播，幼犬最易感染。目前，犬細(xì)小病毒病已經(jīng)在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。疫苗接種是防控犬細(xì)小病毒病的最有效方法。犬細(xì)小病毒病滅活疫苗只能誘導(dǎo)一個(gè)短期的免疫反應(yīng);由于新的抗原變異毒株的出現(xiàn)，弱毒疫苗接種有時(shí)會(huì)出現(xiàn)免疫失敗。
　　

2、隨著反向遺傳技術(shù)的發(fā)展和成熟，單股負(fù)鏈RNA病毒成為了疫苗載體的研究熱點(diǎn)。犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引發(fā)的感染多種動(dòng)物的急性致死性傳染病，給我國(guó)的犬養(yǎng)殖業(yè)和毛皮動(dòng)物業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。目前，全世界應(yīng)用最為廣泛的犬瘟熱疫苗是弱毒疫苗。利用犬瘟熱弱毒疫苗為載體，研制犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱二聯(lián)活載體疫苗，可實(shí)現(xiàn)一苗兩防，降低疫苗生產(chǎn)成本，也可針對(duì)新出現(xiàn)的

3、抗原變異亞型毒株快速地進(jìn)行疫苗更新。
　　按照哺乳動(dòng)物的密碼子偏好性對(duì)外源抗原蛋白基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，能夠提高該蛋白在哺乳動(dòng)物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量，為提高疫苗的免疫效力提供了新的方法。本研究，利用本實(shí)驗(yàn)已建立的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8的反向遺傳技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建了表達(dá)密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白的重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2opti。免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，重組病毒r20/8-CPVVP2op

4、ti感染的BHK-21細(xì)胞中，CPVVP2蛋白得到了正確表達(dá)。重組病毒r20/8-CPVVP2opti保持了親本毒株r20/8在Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定具有生長(zhǎng)滴度高的特點(diǎn)，其最高生長(zhǎng)滴度可達(dá)到106.75 TCID50/ml。Western blot證實(shí)，密碼子優(yōu)化可顯著提高CPVVP2蛋白在重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2opti感染細(xì)胞中的表達(dá)量。以表達(dá)密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVV

5、P2opti表達(dá)野生型CPVVP2蛋白重組犬瘟熱病毒r20/8-CPVVP2和親本毒株r20/8分別按104.5 TCID50/100μl/只的劑量以肌肉注射的方式，兩次免疫接種小鼠。r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2和r20/8免疫小鼠，均誘導(dǎo)低水平的CDV中和抗體反應(yīng)，且3組免疫小鼠血清中CDV中和抗體滴度無顯著性差異;然而，r20/8-CPVVP2opti、r20/8-CPVVP2免疫小鼠，均可誘導(dǎo)顯著的C

6、PV血凝抑制(HI)抗體反應(yīng)，加強(qiáng)免疫后1周，CPVHI抗體反應(yīng)顯著增強(qiáng)，且r20/8-CPVVP2opti免疫小鼠血清中CPV HI抗體滴度顯著地高于r20/8-CPVVP2免疫小鼠免疫小鼠血清中CPV HI抗體滴度。結(jié)果表明，利用密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白基因構(gòu)建CPV、CDV活載體疫苗，能增強(qiáng)在免疫動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)的CPV HI抗體反應(yīng)，有助于提高該疫苗抗CPV感染的免疫效力。
　　本研究結(jié)果表明，表達(dá)密碼子優(yōu)化CPVVP2蛋白