葡萄無(wú)核育種技術(shù)研究及種質(zhì)創(chuàng)新.pdf

1、葡萄育種中,無(wú)核是其重要的選育目標(biāo)之一。隨著人們生活水平的不斷提高,無(wú)核葡萄在鮮食和制干上顯示出越來(lái)越重要的作用。在國(guó)際市場(chǎng)中,銷(xiāo)售量最大、最受人們歡迎的鮮食和制干品種主要是無(wú)核品種。但目前無(wú)核葡萄品種少,現(xiàn)有的品種大多果粒小、結(jié)實(shí)率低、無(wú)香味或香味不濃,培育經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的無(wú)核品種是葡萄育種的重要方向之一。 無(wú)核葡萄育種開(kāi)始于美國(guó),主要通過(guò)傳統(tǒng)雜交育種方式。現(xiàn)育出的無(wú)核品種中絕大多數(shù)(70％多)是以有核品種為母本,無(wú)核品種作父本

2、進(jìn)行人工雜交育成。毋庸置疑,雜交育種無(wú)論是過(guò)去、現(xiàn)在和將來(lái)都是無(wú)核葡萄品種育種重要的方法。近年來(lái),隨著生物技術(shù)的發(fā)展,胚和胚珠培養(yǎng)技術(shù)、三倍體育種技術(shù)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在葡萄育種和生產(chǎn)上應(yīng)用以及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等技術(shù)為培育無(wú)核品種提供了新方法和新思路。 本研究主要根據(jù)無(wú)核葡萄形成的機(jī)理,利用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑花前處理無(wú)核葡萄品種形成種子；二倍體與四倍體雜交培育三倍體；利用四倍體自交產(chǎn)生三倍體；實(shí)生條件下二倍體雄性不育種質(zhì)獲得；以及葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系建

3、立和轉(zhuǎn)雄性不育Barnase基因種質(zhì)獲得等方面研究葡萄無(wú)核品種選育的可能途徑。取得主要研究結(jié)果如下： 1.利用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促使假單性結(jié)實(shí)的無(wú)核葡萄產(chǎn)生具有生活力的種子,采用或不采用胚培養(yǎng)產(chǎn)生實(shí)生苗,為無(wú)核葡萄育種提供一條便捷途徑。采用不同生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞分裂素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘火星無(wú)核’葡萄花前2w進(jìn)行不同濃度的處理,對(duì)果實(shí)的有核率、種子形成大小、單果種子數(shù)目及種子成苗等方面進(jìn)行了研究。BA、CPPU、KT、IAA、IBA、NAA

4、不同濃度的處理都能使‘火星無(wú)核’葡萄產(chǎn)生殘核。BA 5mg/L、10 mg/L,IAA 10 mg/L、20 mg/L,IBA 20 mg/L的處理有核率達(dá)100％；KT 5 mg/L處理種子大小指數(shù)96.6％,為最大,而CPPU 10 mg/L處理種子大小指數(shù)74.5％,為最小；BA 5 mg/L處理單果的平均種子數(shù)3.1粒,CPPU 10 mg/L處理單果的平均種子數(shù)0.5粒。KT 5 mg/L和10 mg/L處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的種子離體

5、培養(yǎng)得到萌發(fā)苗。不同濃度KT和BA處理‘火星無(wú)核’葡萄幼果內(nèi)源IAA、iPAs及IAA/iPAs在花后1w明顯高于對(duì)照。結(jié)果表明,生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞分裂素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)無(wú)核葡萄形成具有生活力的種子,可為無(wú)核葡萄育種提供了一種新的簡(jiǎn)便方法。 2.以二倍體葡萄品種和四倍體葡萄品種為親本進(jìn)行正反交,采用胚珠培養(yǎng)和田間自然播種雜交種子的方法,以期獲得三倍體雜種單株。不同品種組合雜交坐果率不同,魏可(2x)×翠峰(4x)組合坐果率達(dá)41

6、.03％,紅高(2x)×巨峰(4x)的組合雜交坐果率為0％,不同組合間差異顯著；取花后70d的胚珠接種于MS基本培養(yǎng)附加不同激素的培養(yǎng)基中,亞歷山大(2x)×翠峰(4x)組合獲得5株實(shí)生苗。自然播種雜交種子215粒,其中雜交組合‘魏可’ב翠峰’、‘巨峰’ב紅高’、‘魏可’ב巨峰’的種子發(fā)芽成苗,成苗率分別為33.33％、20.00％、1.85％。 3.取四倍體品種‘翠峰’自交種子進(jìn)行播種,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)生后代的單株染

7、色體倍性,發(fā)現(xiàn)單株2004-5-11為三倍體植株；該單株花粉粒通過(guò)電子顯微鏡掃描顯示花粉粒大多呈三角型,與‘夏黑’(3x)花粉粒形態(tài)相近；葉片氣孔大小為0.04×0.022mm(L×B);花前套袋自交果粒為2.71g,無(wú)核,花期12.5 mg/L GA3處理一次,花后10d 25 mg/LGA3+5mg/L CPPU再處理一次,果實(shí)為15.61g,無(wú)核率100％,可溶性固型物(TSS)為16.7 Brix°,該單株為一優(yōu)異的三倍體種質(zhì)。

8、 4.從‘魏可’(Wink)葡萄自交實(shí)生群體中發(fā)現(xiàn)一株雄蕊反卷的單株(2004-6-12),經(jīng)花粉生活力測(cè)定、花粉粒電鏡掃描和電鏡透射觀察,結(jié)果表明：該單株花粉粒在人工培養(yǎng)基上發(fā)芽率為0％,電鏡掃描花粉粒為圓球形、小型、無(wú)發(fā)芽孔和發(fā)芽溝,外壁紋飾為網(wǎng)狀,花粉粒橫切面邊緣光滑,確定為雄性不育單株(雌能花);該單株經(jīng)花期GA3 25 mg/L和花后10d GA3 25 mg/L+CPPU 5 mg/L處理,單果10.2g,果實(shí)無(wú)核率

9、100％,可溶性固形物(TSS)23 Bdx°,果實(shí)紫紅色,品質(zhì)優(yōu)良。 5.以‘美人指’葡萄帶腋芽的幼嫩莖段為外植體,研究了外植體的采集時(shí)間、節(jié)位、和消毒方法因素對(duì)‘美人指’葡萄無(wú)菌苗體系建立的影響。結(jié)果表明,晴天采集2～4節(jié)位的莖段,采用70％酒精10s+0.1％升汞6min+含0.05％吐溫的2％次氯酸鈉6min方法消毒,外植體成活率達(dá)80％以上,萌芽率達(dá)90％。成功的建立‘美人指’葡萄無(wú)菌體系。 對(duì)6-BA、TDZ

10、與IBA不同濃度組合對(duì)‘美人指’葡萄葉片、葉柄和莖段不定芽離體誘導(dǎo)再生植株的效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：以莖段為外植體在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.01 mg/L培養(yǎng)基上分化效果最好,再生率75.00％：葉片、葉柄分別在MS+6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上分化效果較好,再生率分別為63.16％和40.00％:TDZ和IBA的幾種組合

11、都能誘導(dǎo)不定芽再生,但再生率不高。 6.以‘美人指’葡萄離體葉片及葉柄為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化Barnase基因的受體,對(duì)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、卡那霉素選擇壓以及頭孢霉素濃度等因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：農(nóng)桿菌侵染4min,共培養(yǎng)3d,卡那霉素選擇壓2.5mg/L,頭孢霉素濃度250mg/L為最佳的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法‘美人指’葡萄遺傳轉(zhuǎn)化體系。 7.采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系,對(duì)‘美人指’進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共獲得了13株抗性

12、苗,農(nóng)桿菌侵染后的抗性陽(yáng)性率為1.92％。利用GUS組織化學(xué)染色、PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,其中2株抗性苗GUS染色呈陽(yáng)性,且1株P(guān)CR檢測(cè)呈陽(yáng)性,初步證實(shí)Barnase基因已經(jīng)整合進(jìn)入‘美人指’葡萄基因組中。 8.以‘魏可’葡萄花序?yàn)檗r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化Barnase基因的受體,利用花粉管通道法對(duì)魏可進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共獲得了50株后代單株。利用GUS組織化學(xué)染色、PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,13株GUS染色呈陽(yáng)性,GUS陽(yáng)性率為