RASGRF1在結(jié)直腸癌組織中的高表達及其意義的研究.pdf

1、目的:
　　通過免疫組織化學二步法檢測結(jié)直腸癌病人癌組織和癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤中RASGRF1的表達，進一步分析結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性，探討其在結(jié)直腸癌中的可能作用及臨床意義。通過RNAi技術(shù)下調(diào)KRAS突變型結(jié)腸癌細胞株HCT116的RASGRF1表達水平，檢測對細胞增殖、凋亡、細胞周期及細胞遷移能力影響，初步探討RASGRF1對結(jié)腸癌細胞株生物學行為作用，為結(jié)直腸癌早期診斷、預后及靶

2、向治療提供新的分子靶標。
　　方法:
　　1.收集廣東省人民醫(yī)院2008年至2011年間經(jīng)病理組織學證實診斷，具有完整病例資料的35例非連續(xù)結(jié)直腸癌組織、35例癌旁正常結(jié)腸組織（距離癌組織大于5cm以外的癌旁組織）、35例結(jié)直腸腺瘤組織石蠟包埋標本。
　　2.用EnVision二步法進行免疫組織化學染色，檢測RASGRF1在結(jié)直腸癌組織、結(jié)腸腺瘤組織、癌旁正常組織石蠟切片中表達部位及強度。
　　3.轉(zhuǎn)染KRAS突

3、變型結(jié)腸癌細胞HCT116:轉(zhuǎn)染時細胞融合度達70％左右。設(shè)置實驗組、陰性對照組及空白對照組。按照每孔200μL Opti-MEM Reducedserum Medium及每孔5μL MAX的量分別取適量，進行混合，此為溶液A。
　　4.CCK-8檢測細胞增殖:取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細胞，取適量胰酶消化，制備細胞懸液，進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至104個每孔，接種至96孔板。培養(yǎng)24小時，按照上述方法轉(zhuǎn)染RASGRF1 s

4、iRNA及陰性對照，培養(yǎng)48小時;每孔加入10μL CCK-8，用酶標儀在450nm波長下分別測定加入CCK-8后24小時、48小時、72小時的OD值。以時間為橫軸，增殖率為縱軸繪制生長曲線。
　　5.細胞凋亡實驗:取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細胞，細胞轉(zhuǎn)染后48小時后，將細胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15ml的錐形管中并置于冰上。用2 ml冰PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內(nèi)細胞，去除PBS溶液。加入0.5ml0.25％不含EDTA

5、胰酶，收集細胞。將細胞輕輕重懸于上述的培養(yǎng)基中使得其密度大約為1×106細胞/ml。將0.5 ml細胞懸液從細胞培養(yǎng)板中（5×105個細胞）轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管內(nèi)。加入1.25μl AnnexinⅤ-FITC，室溫(18-24℃)避光反應15分鐘。室溫1000×g離心5分鐘，去除上清。將細胞用0.5 ml預冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10μl Propidium Iodide。將樣本放置在冰上避光保存。立即用流式細胞儀檢測分析。<

6、br>　　6.取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細胞，細胞轉(zhuǎn)染后48小時后每樣收集1×106細胞細胞固定:離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次，加入預冷70％乙醇，于4℃固定過夜。細胞染色:離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化丙錠(PI)，100ug/mL RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分鐘。流式分析:以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2-3萬個細胞

7、，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。
　　7.細胞遷移實驗:取生長良好無污染且處于對數(shù)期的細胞，細胞轉(zhuǎn)染后48小時后，吸除原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入滅菌的PBS洗液，輕輕漂洗。加入適量0.25％的胰蛋白酶，收集細胞，轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中離心，計數(shù)1×105個細胞，用100ul無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細胞培養(yǎng)板的小室上室，在下室加入600ul完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4％多聚甲醛

8、固定20min，PBS洗滌一次，結(jié)晶紫染色10min，PBS洗滌一次，顯微鏡下觀察細胞穿過小孔數(shù)目，并拍照統(tǒng)計。
　　8.統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對正態(tài)分布的連續(xù)性變量采用((x)±s)描述，非正態(tài)分布的連續(xù)性數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述。采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）比較RASGRF1在結(jié)直腸癌組織切片和結(jié)腸腺瘤、癌旁正常組織切片的表達情況。RASG

9、RF1表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U檢驗）及多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis H檢驗)。采用One-way ANOVA分析分別比較KRAS突變型結(jié)腸癌細胞HCT116 RASGRF1 siRNA50nm組、RASGRF1 siRNA100nm組、RASGRF1 siRNA200nm組與陰性對照組的RASGRF1 mRNA表達水平之間的差異;采用重復

10、測量數(shù)據(jù)的方差分析及One-way ANOVA分析分別比較KRAS突變型結(jié)腸癌細胞HCT116 RASGRF1 siRNA24小時組、RASGRF1 siRNA48小時組、RASGRF1 siRNA72小時組與陰性對照組的細胞增殖變化的差異，當滿足方差齊性時采用LSD法比較組間差異，當不滿足方差齊性時采用Dunnett T3法比較組間差異;采用Kruslal-Wallis H檢驗分析KRAS突變型結(jié)腸癌細胞HCT116RASGRF1 s

11、iRNA、陰性對照、HCT116細胞凋亡變化。應用Kruslal-Wallis H檢驗分析RASGRF1 siRNA組、陰性對照組、HCT116組處于G1期細胞差異;用One-way ANOVA分析分別比較RASGRF1 siRNA組、陰性對照組、HCT116組處于S期細胞差異，當滿足方差齊性時采用LSD法比較組間差異，當不滿足方差齊性時采用Dunnett T3法比較組間差異;HCT116 RASGRF1 siRNA、陰性對照、HCT1

12、16細胞組細胞遷移能力比較用Kruslal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)腸癌組織、癌旁正常組織及結(jié)腸腺瘤組織中RASGRF1的表達情況
　　RASGRF1陽性表達主要表現(xiàn)為胞漿中出現(xiàn)棕黃色或深棕色顆粒。RASGRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織、結(jié)直腸腺瘤組織均表達于細胞漿中，未見明顯胞核染色。RASGRF1在結(jié)直腸癌組織、腺瘤組織及癌旁正常組織中表達有差異(P=

13、0.038)，癌組織高于腺瘤及癌旁正常組織，腺瘤組織高于癌旁正常組織。35例結(jié)直腸腺瘤中17例為管狀腺瘤，18例為絨毛管狀腺瘤，17例管狀腺瘤組織切片中，二者在RASGRF1表達上差異無統(tǒng)計學意義(P=0.171)。
　　2.結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系
　　進一步分析結(jié)直腸癌組織RASGRF1表達水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性顯示，RASGRF1蛋白表達與性別(P=0.021)、組織分型(P=0

14、.009)、有無遠處轉(zhuǎn)移(P=0.019)及TNM分期(P=0.001)相關(guān)，女性高于男性;粘液腺癌、印戒細胞癌高于腺癌;有遠處轉(zhuǎn)移者高于無遠處轉(zhuǎn)移;TNMⅢ、Ⅳ期高于TNMⅠ、Ⅱ期。與年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、分化不相關(guān)(P＞0.05)
　　3.CCK8法檢測RASGRF1下調(diào)后對結(jié)腸癌細胞HCT116增殖能力影響
　　轉(zhuǎn)染后48小時，三組增殖率差別有統(tǒng)計學意義(P=0.007)，RASGRF1 siRNA組增殖速度慢于

15、HCT116組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005);轉(zhuǎn)染后72小時，三組細胞增殖有差異(P=0.000)，與NC組及HCT116組相比，RASGRF1 siRNA組增殖速度明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000及P=0.000);NC組與HCT116組間差別無統(tǒng)計學意義(P=0.333)。
　　4.AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測下調(diào)RASGRF1后對HCT116細胞凋亡影響
　　通過流式細胞儀檢測了RASGRF1

16、 siRNA轉(zhuǎn)染后細胞凋亡情況，RASGRF1siRNA組早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及總凋亡細胞均多于NC組和HCT116組(P=0.027)，下調(diào)RASGRF1可增加細胞凋亡。
　　5.下調(diào)RASGRF1后對HCT116細胞周期影響
　　轉(zhuǎn)染48小時后，通過流式細胞儀檢測RASGRF1 siRNA對KRAS突變型結(jié)腸癌細胞株HCT116細胞周期的影響，結(jié)果顯示:RASGRF1 siRNA組細胞處于G1多于NC組及HCT11

17、6組(P=0.039)，表明下調(diào)RASGRF1后HCT116細胞阻滯于G1期。與NC組及HCT116組相比，RASGRF1 siRNA組處于S期細胞明顯減少(P=0.000)，下調(diào)RASGRF1后細胞分裂減少。
　　6.下調(diào)RASGRF1后對結(jié)腸癌HCT116遷移能力影響
　　Transwell細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)48小時后RASGRF1 siRNA組穿過小室的細胞明顯少于NC組及HCT116組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)