丹參酮ⅡA對心肌肥厚的防治作用及其機制探討.pdf

1、第一章腹主動脈縮窄性大鼠心肌肥厚病變及丹參酮ⅡA的干預作用　　目的： 已知氧化損傷參與了壓力超負荷引起的心肌肥厚等病理過程，在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中都起重要作用。傳統(tǒng)中藥丹參的主要脂溶性單體丹參酮ⅡA是一種有效的抗氧化劑，本實驗通過建立腹主動脈縮窄性大鼠模型，觀察壓力超負荷模型大鼠心肌肥厚和心肌纖維化病變，研究丹參酮Ⅱ A是否對這些病變具有改善作用及其作用的可能機制。 方法： 采用腹主動脈縮窄法(AAC)建立

2、心肌肥厚模型。健康SD雄性大鼠50只，體重190-210g，隨機取40只造模，余下10只做假手術。造模結束后一周，存活的35只手術組大鼠隨機分為三組：模型組(AAc，n=13)，灌胃給予0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)：模型加丹參酮ⅡA高劑量組(TH，n=11)，灌胃給予丹參酮Ⅱ 結果： 1、大鼠AAC5周后，AoSP、AoDP、LVSP以及LVEDP顯著升高；±dp/dtmax也有一定增高，但沒有統(tǒng)計學差異，這說明

3、AAC大鼠術后血壓明顯升高，并出現(xiàn)了心臟收縮、舒張功能的障礙，在體心功能下降。高劑量丹參酮ⅡA能顯著降低LVEDP，在一定程度上改善AAC大鼠心功能，糾正血流動力學紊亂，但無明顯降血壓作用。低劑量丹參酮ⅡA對血流動力學的改善作用不明顯。 2、大鼠AAC5周后左心室重量與體重比值(LVW/BW)明顯增大；HE染色切片顯示模型組大鼠左心室呈明顯的向心性肥厚生長，VG染色顯示心肌膠原容積分數(shù)(CVF)明顯增大。這些指數(shù)說明AAC大鼠術

4、后5周發(fā)生了明顯的心肌肥厚、心肌纖維化。丹參酮Ⅱ A能夠顯著抑制這些變化，并具有劑量依賴性。 3、檢測到AAC大鼠心肌中MDA濃度顯著升高；應用共聚焦顯微鏡也檢測到AAC組大鼠心室肌中O2·-產(chǎn)生明顯增多，說明氧化應激反應增強。丹參酮ⅡA能夠劑量依賴性減弱心肌組織的氧化應激狀態(tài)。 4、RT-PCR和Western blot方法都顯示CTGF表達水平在AAC組大鼠明顯上調(diào)，丹參酮Ⅱ A劑量依賴性降低CTGF的表達。

5、 結論： 1、本實驗通過復制腹主動脈縮窄性心肌肥厚大鼠模型，觀察到血流動力學紊亂及心功能受損的表現(xiàn)，伴有明顯的心肌纖維化發(fā)生。 　　2、腹主動脈縮窄模型大鼠心肌處于強的氧化應激狀態(tài)，并伴有促纖維化細胞因子CTGF的表達上調(diào)。 3、丹參酮ⅡA能通過減輕氧化應激狀態(tài)、下調(diào)CTGF表達，有效改善腹主動脈縮窄大鼠的心功能失調(diào)及心肌纖維化程度，且呈劑量依賴性。但對血壓無明顯影響。 第二章丹參酮ⅡA對阿霉素誘導的乳鼠心肌細

6、胞凋亡的保護作用及分子機制　　目的： 心肌細胞在各種刺激下可發(fā)生凋亡，導致心肌細胞的丟失及繼發(fā)性成纖維細胞的增殖和瘢痕形成，最終導致心臟收縮和舒張功能受損，誘發(fā)心臟衰竭。氧化應激是不同心血管疾病中誘發(fā)心肌細胞凋亡的主要因素。氧化應激誘導的心肌細胞凋亡參與了臨床常用抗腫瘤藥阿霉素的心肌毒性作用，自由基清除劑可對抗阿霉素誘導的心肌細胞凋亡。本研究的目的在于研究丹參酮Ⅱ A是否對阿霉素誘導的乳鼠心肌細胞凋亡具有保護作用，并探討其可能

7、存在的分子機制。 結果： 1.在本實驗中，1 μ M阿霉素作用于心肌細胞24h后，細胞存活率明顯下降，Hoechst染色顯示在正常心肌細胞核之間有散在分布的凋亡細胞核，流式細胞儀檢測到細胞凋亡峰的面積明顯增大。 2.丹參酮ⅡA預處理心肌細胞可劑量依賴性抑制阿霉素誘導的細胞存活率下降，Hoechst染色顯示的細胞凋亡百分率有明顯下降，流式細胞儀的定量檢測也得到類似結果。 3.1 μ M阿霉素作用于心肌細胞2

8、4h后，倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測顯示細胞內(nèi)DCF和DHE熒光強度明顯增強，2 μ M丹參酮ⅡA預處理可減少阿霉素引起的心肌細胞活性氧產(chǎn)生。 4.1 μ M阿霉素明顯下調(diào)心肌細胞Bcl-2表達并上調(diào)Bax表達水平，Bcl-2/Bax比值下降，2 μ M丹參酮ⅡA預處理可上調(diào)阿霉素引起的Bcl-2/Bax比值下降。 結論： 1、在本實驗條件下，阿霉素引發(fā)體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞的氧化應激狀態(tài)，而誘導心肌細胞發(fā)生凋

9、亡。 2、丹參酮ⅡA劑量依賴性抑制阿霉素誘導的心肌細胞凋亡，丹參酮ⅡA的心肌細胞保護作用至少部分是通過它的抗氧化能力而實現(xiàn)的。 第三章 AngⅡ?qū)w外培養(yǎng)的心臟成纖維細胞細胞外基質(zhì)合成的影響及丹參酮ⅡA的干預作用　　目的： 血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是心肌膠原網(wǎng)絡重塑的重要促進因子，循環(huán)和組織的Ang Ⅱ濃度增高，可促進心肌細胞肥大和間質(zhì)纖維化，從而參與了心肌重塑的病理過程。心臟成纖維細胞是心臟中數(shù)量最多的細胞，各

10、種原因?qū)е碌男呐K成纖維細胞的細胞外基質(zhì)合成過多可造成心肌纖維化的發(fā)生，體外研究心臟成纖維細胞具有重要的指導價值。本實驗通過復制AngⅡ誘導的成年大鼠心臟成纖維細胞(CFbs)膠原表達的細胞模型，研究丹參酮ⅡA對CFbs細胞外基質(zhì)合成的影響并探討其機制。 結果： 1、通過檢測3H標記的脯氨酸(3H-proline)摻入發(fā)現(xiàn)，10-10M到10-6M Ang Ⅱ誘導心臟成纖維細胞膠原合成具有劑量依賴性，Ang Ⅱ在10-8M

11、時對膠原合成的誘導效果達到平臺期。 2、10-7M AngⅡ作用于CFbs 24h后顯著增加了3H-proline摻入量，2μ M和1μ M TSN預處理則劑量依賴性的抑制了Ang Ⅱ的作用。 3、10-M Ang Ⅱ使CTGF、FN和CollagenⅠI轉錄明顯增加，10 μ M纈沙坦(AT1R拮抗劑)使各基因轉錄恢復到接近基礎水平，說明Ang Ⅱ促進CTGF、FN和CollagenⅠ轉錄的效果絕大部分是通過AT1受體

12、發(fā)揮的。2 μ M和1 μ M TSN預處理1h則劑量依賴性的抑制了AngⅡ的作用，其中2μ M TSN效果與10μ M纈沙坦相當。 4、10-7M Ang Ⅱ作用CFbs 24h后使CTGF和FN蛋白表達明顯上調(diào)，10 μ M纈沙坦使CTGF和FN蛋白表達恢復到接近基礎水平，說明Ang Ⅱ誘導的CTGF和FN蛋白表達的效果絕大部分是通過AT1受體發(fā)揮的。2 μ M和1 μ M TSN預處理1h則劑量依賴性的抑制了Ang Ⅱ的作

13、用，其中2μ M TSN效果與10 μ M纈沙坦效果相當。 5、使用倒置熒光顯微鏡在正常情況下可以在細胞內(nèi)檢測到少量紅色熒光，10-7MAngμ作用于細胞后，熒光明顯增強，2μ M和1 μ M TSN預處理都明顯抑制了Ang Ⅱ的作用，10 μ M纈沙坦可完全拮抗Ang Ⅱ的作用，使熒光強度恢復到正常水平。流式細胞儀檢測也得到了類似的結果。 結論： 1、體外成功復制了Ang Ⅱ促進心臟成纖維細胞膠原表達增高的模型。

14、 2、丹參酮ⅡA劑量依賴性抑制Ang Ⅱ促進CFbs細胞外基質(zhì)表達的作用，該作用主要通過AT1受體介導，與抑制細胞膠原合成有關。 3、Ang Ⅱ可加強CFbs氧化應激反應并使CTGF表達上調(diào)，該作用主要通過AT1受體介導；丹參酮ⅡA可減輕Ang Ⅱ誘導的細胞氧化應激并下調(diào)CTGF的表達。 第四章 CTGF在Ang Ⅱ誘導的體外培養(yǎng)心臟成纖維細胞細胞外基質(zhì)合成中的表達變化、調(diào)控機制　　目的： CTGF是新近發(fā)現(xiàn)

15、的具有多種生物學功能的生長因子，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，尤其與纖維化性疾病關系密切。本實驗研究目的在于檢測CTGF在AngⅡ刺激的體外培養(yǎng)CFbs膠原合成過程中的表達變化，驗證CTGF在此過程中是否具有關鍵性作用。之后探討ERK1/2磷酸化信號通路在CTGF表達調(diào)控中的作用。 結論： 1、Ang Ⅱ誘導CTGF表達具有隨時間和劑量變化的趨勢。 2、三對干擾序列中，stealth_1791(S1)