早期應(yīng)激對(duì)海馬學(xué)習(xí)、記憶功能的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 早期應(yīng)激與成年后行為的變化、對(duì)應(yīng)激的生理響應(yīng)的變化和對(duì)精神疾病的易感性有關(guān)。動(dòng)物和人的研究都已證實(shí)腦在幼兒早期對(duì)應(yīng)激尤其敏感。在此期間經(jīng)歷的應(yīng)激事件可能會(huì)造成神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生永久性的改變，而這些改變可能與成年時(shí)發(fā)生的精神疾病有關(guān)。母愛剝奪(maternal deprivation，MD)是一個(gè)已經(jīng)建立的成熟的早期應(yīng)激動(dòng)物模型，并被應(yīng)用于與精神疾病病理和致病因素相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)研究。即使在對(duì)大多數(shù)成年應(yīng)激源都沒(méi)有顯著響應(yīng)的

2、低應(yīng)激反應(yīng)期(SHRP)，持續(xù)的母愛剝奪也會(huì)產(chǎn)生十分不利的影響。海馬的許多功能都可以被早期經(jīng)歷的惡性應(yīng)激所改變。首先，海馬參與HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。應(yīng)激后造成的海馬或穹窿的損傷可以導(dǎo)致HPA軸的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)功能恢復(fù)減慢。其次，海馬是調(diào)節(jié)與焦慮相關(guān)的行為的重要結(jié)構(gòu)。海馬損傷的大鼠在行為測(cè)試中如對(duì)新環(huán)境的探索、社會(huì)接觸等表現(xiàn)出較少的焦慮。再次，海馬在空間導(dǎo)向?qū)W習(xí)能力方面發(fā)揮重要作用。海馬的損傷就會(huì)對(duì)空間導(dǎo)向?qū)W習(xí)能力產(chǎn)生影響。早期經(jīng)歷母愛剝奪，異

3、常的海馬發(fā)育就可能導(dǎo)致上述情形的出現(xiàn)。
　　 目前關(guān)于母愛剝奪對(duì)海馬結(jié)構(gòu)和功能的作用機(jī)制缺乏詳盡細(xì)致的研究，因而在許多方面沒(méi)有明確的結(jié)論。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，特別考慮母愛剝奪的模式和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別等因素，從分子機(jī)制和神經(jīng)行為學(xué)兩個(gè)角度探討母愛剝奪對(duì)海馬的學(xué)習(xí)、記憶功能的作用和機(jī)制。
　　 目的：
　　 1.觀察母愛剝奪對(duì)雌雄大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。
　　 2.觀察不同模式的母愛剝奪對(duì)雌雄大鼠海馬的Gl

4、ucocorticoids receptors，Calretnin和Calbindin D-28k蛋白表達(dá)的影響。
　　 3.觀察母愛剝奪對(duì)雌雄大鼠成年后對(duì)應(yīng)激響應(yīng)的影響。
　　 方法：
　　 1)建立3種不同模式的SD大鼠的母愛剝奪模型：MD，在PND2-PND14(出生后第2天到第14天)期間，幼仔每日與母鼠分離3h(9:00-12:00)；MD4，在PND4，幼仔與母親分離24h(9:00-9:00)；MD

5、9，在PND9，幼仔與母親分離24h(9:00-9:00)。
　　 2)比較MD組和CON組(對(duì)照組)雌雄大鼠在PND21的體重。
　　 3)比較MD組和CON組(對(duì)照組)雌雄大鼠在PND21的海馬的神經(jīng)發(fā)生情況。對(duì)大鼠腦組織的冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，用ki67估測(cè)海馬齒狀回的細(xì)胞的增殖，用Doublecortin估測(cè)海馬齒狀回未成熟的神經(jīng)元數(shù)目。
　　 4)對(duì)MD組和CON組(對(duì)照組)雌雄大鼠在PND21進(jìn)行

6、曠場(chǎng)測(cè)驗(yàn)，比較它們的探索行為和自主活動(dòng)性。
　　 5)采用western blot和QT-PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的糖皮質(zhì)激素受體(GR)的水平。
　　 6)采用western blot和QT-PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的ealretinin蛋白和其mRNA的表達(dá)水平。
　　 7)采用western blot和QT-

7、PCR比較MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21的海馬的calbindin-D28k蛋白和其mRNA的表達(dá)水平。
　　 8)對(duì)MD組、MD4組、MD9組和CON組的雌雄大鼠在PND21進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)驗(yàn)，檢測(cè)它們的焦慮狀況。
　　 9)對(duì)MD組和CON組(對(duì)照組)雌雄大鼠在PND25進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)驗(yàn)，比較它們的學(xué)習(xí)、記憶能力。
　　 10)在PND35，采用western blot

8、比較參加水迷宮測(cè)試的和未參加水迷宮測(cè)試的MD組和CON組的雌雄大鼠的海馬的calretinin蛋白水平。
　　 11)在PND35，采用western blot比較參加水迷宮測(cè)試的和未參加水迷宮測(cè)試的MD組和CON組的雌雄大鼠的海馬的calbindin-D28k蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.雌性大鼠和雄性大鼠在出生后第21天的體重并沒(méi)有差別。不論是雄性大鼠還是雌性大鼠，MD組的體重都極其顯著低于對(duì)照組的(p

9、<0.001)。
　　 2.在PND21，雄性大鼠的DCX+細(xì)胞數(shù)目要顯著高于雌性大鼠的(p<0.001)。對(duì)雄性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的DCX+細(xì)胞數(shù)目極其顯著多于對(duì)照組的(p<0.001)。對(duì)于雌性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的DCX+細(xì)胞數(shù)目則極其顯著低于對(duì)照組的(p<0.001)。
　　 3.在PND21，雄性大鼠和雌性大鼠的ki67+細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有顯著差別(p>0.05)。雄性大鼠的MD組的較對(duì)照組的海馬的細(xì)胞增殖減少(p<0.0

10、5)。而雌性大鼠的MD組和對(duì)照組之間的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 4.在曠場(chǎng)測(cè)試中，雄性大鼠的總運(yùn)動(dòng)和總運(yùn)動(dòng)時(shí)間都顯著高于雌性大鼠的(p<0.05)。對(duì)雄性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的總運(yùn)動(dòng)距離和和總運(yùn)動(dòng)時(shí)間都顯著低于對(duì)照組的(p<0.05)。而雌性大鼠兩組之間沒(méi)有明顯差別(p>0.05)。
　　 5.在PND21，雄性大鼠海馬的CALR水平低于雌性大鼠的[F(1，47)=74.8，p<0.001]。Post h

11、oc比較說(shuō)明，MD組和MD9組的雄性大鼠的海馬CALR表達(dá)顯著高于對(duì)照組的，而MD4組的與對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差別。MD組的雄性大鼠的海馬的CALR比MD9組的豐富。與對(duì)照組相比，MD組、MD4組和MD9組的雌性大鼠的海馬的CALR水平都顯著增高。MD組的雌性大鼠的海馬的CALR表達(dá)高于MD4組的，而MD4組的和MD9組的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.在PND21，雌性大鼠的海馬的CALB水平顯著高于雄性大鼠的[F(1，47)

12、=75.67，p<0.001]。MD組的MD9組的雄性大鼠的海馬的CALB表達(dá)都明顯高于對(duì)照組的，而MD4組的則低于對(duì)照組的。同時(shí)我們觀察到MD組的雄性大鼠的海馬的CALB水平高于MD9組的。對(duì)雌性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的海馬的CALB表達(dá)顯著高于對(duì)照組的。另外，MD4組的和MD9組的CALB表達(dá)明顯降低，而MD9組的CALB水平最低。
　　 7.在PND21，雌性大鼠海馬的GR mRNA、CALR mRNA和CALB mRNA表達(dá)均

13、顯著高于雄性大鼠的。對(duì)于雄性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組和MD9組的GR.mRNA、CALRmRNA和CALB mRNA水平明顯高于對(duì)照組的，而MD4組和對(duì)照組之間沒(méi)有差別。對(duì)于雌性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組、MD4組和MD9組的GR mRNA和CALR mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組的，而MD9組和MD4組的CALB mRNA水平則低于對(duì)照組的。
　　 8.在高架十字迷宮測(cè)試中，與雌性大鼠相比，雄性大鼠在5min的測(cè)試過(guò)程中伸展次數(shù)較多，而且在開臂上

14、的停留時(shí)間較長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，MD組和MD9組的雄性大鼠花費(fèi)較短的時(shí)間在開臂，并且站立次數(shù)、探頭次和伸展次數(shù)都顯著增加，但是MD4組的雄性大鼠與對(duì)照組之間的差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MD組和MD9組的雌性大鼠比對(duì)照組的站立次數(shù)增多。但是MD組、MD4組、MD9組的雌性大鼠與對(duì)照組的其它參數(shù)間(開臂滯留時(shí)間、探頭次數(shù)和伸展次數(shù))的差別不明顯。
　　 9.在Morris水迷宮測(cè)試中，對(duì)照組的雌性大鼠在測(cè)試第一天的平均潛伏時(shí)間顯著高于雄性

15、大鼠的(p<0.05)，后4天沒(méi)有明顯差別。MD組的雌雄大鼠的平均潛伏時(shí)間沒(méi)有顯著差別(p>0.05)。對(duì)于雄性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的平均潛伏時(shí)間在測(cè)試的第一天顯著高于對(duì)照組的(p<0.05)，在第5天極其顯著高于對(duì)照組的(p<0.01)，其余3天沒(méi)有明顯差別(p>0.05)。對(duì)于雌性大鼠來(lái)說(shuō)，MD組的平均潛伏時(shí)間只在第5天極其顯著高于對(duì)照組的(p<0.01)，而其余4天沒(méi)有明顯差別(p>0.05)。
　　 10.在PND35，雌性

16、大鼠和雄性大鼠海馬的CALR水平有顯著差別(p<0.05)。對(duì)于雄性大鼠來(lái)說(shuō)：經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平顯著低于只經(jīng)歷過(guò)母愛剝奪的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平顯著低于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著低于只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的(p<0.01)。對(duì)于雌性大鼠來(lái)說(shuō)：只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的海馬的CALR水平

17、顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平顯著高于只經(jīng)歷過(guò)母愛剝奪的大鼠的(p<0.05)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著高于只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALR水平極其顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.001)。
　　 11.在PND35，雌性大鼠和雄性大鼠海馬的CALB水平有極其顯著的差別(p<0

18、.001)。對(duì)于雄性大鼠來(lái)說(shuō)：只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.001)；只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的(p<0.001)；只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的(p<0.001)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著低于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.001)；經(jīng)歷

19、母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著低于只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的(p<0.001)。對(duì)于雌性大鼠來(lái)說(shuō)：只經(jīng)歷水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.01)；經(jīng)歷母愛剝奪和水迷宮測(cè)試的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.01)；只經(jīng)歷母愛剝奪的大鼠的海馬的CALB水平極其顯著高于沒(méi)有經(jīng)歷任何應(yīng)激的大鼠的(p<0.001)。
　　 結(jié)論：

20、r>　　 1.大鼠在新生期經(jīng)歷母愛剝奪(每日3h，PND2-PND14)，會(huì)影響成年后海馬的神經(jīng)發(fā)生及其功能，并且造成的結(jié)果與大鼠的性別有關(guān)。
　　 2.不同模式的母愛剝奪對(duì)大鼠海馬的GR、CALR和CALB的表達(dá)的作用不同，同時(shí)與大鼠的性別有關(guān)。
　　 3.早期經(jīng)歷母愛剝奪會(huì)對(duì)成年后雌雄大鼠的海馬的學(xué)習(xí)和記憶功能造成一定程度的損害，增加大鼠的焦慮性，降低它們的探索性。
　　 4.早期經(jīng)歷母愛剝奪會(huì)令雌性大鼠對(duì)