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文檔簡介
1、背景及目的:腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase AMPK 屬于絲氨酸/氨酸激酶蛋白激酶,廣泛存在于真核生物細胞中,是細胞能量調(diào)節(jié)的感受器,負責能量調(diào)節(jié)及傳遞。生理狀態(tài)下AMPK 不活躍,當細胞處于應激狀態(tài)和能量耗竭使AMP/ATp比例升高時,AMPK 可被上游基因激活,使AMP/ATp比例恢復正常。近年來的研究資料表明AMPK 激活對腫瘤細胞可產(chǎn)生細胞毒性作用,因此,能使AMPK 激活的藥物將有
2、可能成為抗腫瘤藥物的新選擇。LKB1/AMPK 途徑在正常組織具有抑制腫瘤細胞形成的作用,而在體外,也已被證明其對多數(shù)人類腫瘤細胞株具有毒性作用,其中包括肺癌,前列腺癌,胃癌,乳腺癌。而AMPK 對肝癌細胞是否也存在抑制作用,及其對肝癌細胞周期的影響,目前報道較少。
二甲雙胍是雙胍類藥物的代表藥物,其降血糖作用的臨床應用已有半個多世紀,在我國,二甲雙胍是2 型糖尿病的一線治療藥物。而近年來研究表明,二甲雙胍除了其降血糖作用
3、外,還具有抑制多種腫瘤細胞增殖的作用,包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等。
上述作用被證明是由二甲雙胍激活AMPK 所誘導,目前二甲雙胍對肝癌細胞是否具有生長抑制作用及其機制尚未見報道。本研究將通過二甲雙胍對肝癌細胞PLC/PRF/5 增殖抑制、細胞周期的影響及其作用分子機制的研究,為AMPK 成為抗腫瘤治療的新靶點以及二甲雙胍成為抗腫瘤藥物的應用提供理論依據(jù)。
材料和方法
1. 用含10%胎牛
4、血清,100U/ml 青霉素和100U/ml 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞株PLC/PRF/5 細胞及人宮頸癌細胞株HeLa 細胞;HeLa 細胞缺乏LKB1基因,而LKB1基因是AMPK 上游激酶,因此,實驗中采用HeLa 細胞做為陰性對照。
2. 用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用PLC/PRF/5 細胞15min,以未予藥物處理細胞為對照,Western Blot
5、檢測AMPK 磷酸化程度。
3. 用含不同濃度二甲雙胍(2.5、5.0、10、20mM),AICAR(200、500、1000、2000 μM )的培養(yǎng)基分別處理PLC/PRF/5 細胞24、48、72h ;用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基分別處理HeLa 細胞24、48、72h,以未予藥物處理細胞作對照;噻唑藍比色法(MTT 法)檢測二甲雙胍及AICAR 對PLC/PRF/5 細胞及HeL
6、a 細胞增殖的影響。
4. PLC/PRF/5 細胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用72h,經(jīng)碘化丙啶(PI )單染法,用流式細胞分析儀(FCM )檢測PLC/PRF/5 細胞周期情況。
5. PLC/PRF/5 細胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用72h,DAPI染色觀察PLC/PRF/5 細胞凋亡情況。
結果
7、 1. Western Blot 結果顯示,經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理后,PLC/PRF/5 細胞AMPK 磷酸化程度較對照組明顯增強。
2. MTT 法檢測結果顯示,與對照組比較,二甲雙胍及AICAR 能明顯抑制PLC/PRF/5細胞的生長,并且呈濃度依賴性;而二甲雙胍及AICAR 對HeLa 細胞的生長無抑制作用。
3. 流式細胞術檢測結果顯示,PLC/PRF/5 細胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理
8、24h后,細胞周期發(fā)生停滯,G0-G1 期,S 期,G2-M 期和對照組相比較,差別均具有統(tǒng)計學意義。
4. DAPI染色觀察可見,PLC/PRF/5 細胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理24h后,鏡下可見部分PLC/PRF/5 細胞核碎裂,細胞發(fā)生凋亡。
結論
1. 二甲雙胍及AICAR 能夠使肝癌細胞PLC/PRF/5 AMPK 激活。
2. 二甲雙胍及AICAR 通過激活AMPK
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