1α,25(OH)2D3對不同分化階段成骨細胞RANKL及OPG基因表達的影響.pdf

1、背景和目的
　　骨組織內(nèi)含有三種類型細胞:成骨細胞、破骨細胞、骨細胞。破骨細胞分化因子(receptoractivatorofNF-kBligand，RANKL)是骨改建過程中調(diào)控破骨細胞活化與分化成熟的關(guān)鍵因子;其在巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF)的協(xié)同作用下，與破骨前體細胞及破骨細胞表面的RANK結(jié)合后，可以促進破骨細胞的分化成熟和骨吸收功能并維持其存活狀

2、態(tài)。OPG是RANKL的“餌受體”，可與RANK競爭性結(jié)合RANKL，從而抑制破骨細胞的分化成熟和骨吸收功能，并能誘導破骨細胞的凋亡。因此，可認為RANKL/OPG比值是破骨細胞性骨吸收過程的決定性因素。許多體外實驗表明，來源于骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨細胞系細胞通過表達RANKL以及OPG而參與調(diào)控破骨細胞的分化成熟及骨吸收功能。
　　1α，25(OH)2D3是一種類固醇激素，在體內(nèi)鈣磷代謝過程中發(fā)揮著重要作用，是治療骨質(zhì)疏松的藥物

3、之一。有研究結(jié)果顯示:生理劑量使用時，1α，25(OH)2D3可促進成骨細胞的骨形成功能，但是其對骨形成作用的調(diào)控受成骨細胞分化成熟程度的影響;高劑量使用時，1α，25(OH)2D3卻能刺激骨吸收的發(fā)生。許多研究結(jié)果已經(jīng)報道，RANKL/RANK/OPG細胞因子系統(tǒng)是1α，25(OH)2D3調(diào)控骨吸收的機制之一。目前，1α，25(OH)2D3對RANKL與OPG表達的調(diào)控是否亦隨成骨細胞分化成熟而變化（或如何變化）仍尚不明確。而以上問題

4、的明確會為維生素D治療骨代謝疾病提供有力的理論基礎(chǔ)。
　　實驗方法
　　復蘇培養(yǎng)小鼠成骨細胞系細胞MC3T3-E1。細胞增殖到足夠?qū)嶒炇褂脭?shù)量后，按5000個/cm2將細胞接種于六孔板。然后，待細胞長至約85％融合時用含成骨誘導液（50uM抗壞血酸，10-6M地塞米松及10mMβ-甘油醛磷酸鹽）的培養(yǎng)液誘導細胞分化，并分別在成骨誘導第0，7，14，21，28天后，向培養(yǎng)液中加入1α，25(OH)2D3(10nM)，然后靜置孵

5、育細胞4h;對照組則加等量的無水乙醇。4h后，提取細胞總RNA，并進行q-PCR，以檢測1α，25(OH)2D3對RANKLmRNA與OPGmRNA表達的調(diào)控與成骨細胞分化成熟程度之間的關(guān)系。同時，對不同分化階段OB進行茜素紅染色，以檢測鈣結(jié)節(jié)的形成。
　　實驗結(jié)果
　　ALP、Osteocalcin等mRNA表達水平變化趨勢表明，體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞逐漸分化成熟。在OB分化過程中，對照組RANKL表達無顯著變化;

6、OPG基因表達逐漸增多，在第14天達最高水平(P＜0.05)，之后逐漸下降。1α，25(OH)2D3持續(xù)促進RANKL的表達;RANKL基因在第28天表達水平最高，約為對照組的3.4倍(P＜0.05)。同時，1α，25(OH)2D3持續(xù)抑制OPG基因表達。在OB各個分化階段，施以1α，25(OH)2D3刺激后，實驗組RANKL/OPG比值均比對照組高，并且在細胞分化較晚期階段更明顯。
　　結(jié)論
　　高劑量(10-8M)1α，