斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白家族部分基因的分子克隆及表達(dá)分析.pdf

1、親蝦繁育技術(shù)在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中一直是一個(gè)非常重要的限制因素，而通常采用的眼柄切除技術(shù)或者捕撈野生親蝦的方法在實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)中存在傷害親蝦或者資金投入過(guò)大等問(wèn)題。因此探尋新的親蝦繁育技術(shù)勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)擬在分子層面，以斑節(jié)對(duì)蝦為模式生物對(duì)卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白H，細(xì)胞周期蛋白E等基因進(jìn)行研究，進(jìn)而為斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究打下基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)高通量測(cè)序建立的EST文庫(kù)的基礎(chǔ)上,篩選出了幾個(gè)與卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周

2、期蛋白EST序列,利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆出全長(zhǎng)cDNA序列，并利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)對(duì)這些發(fā)育相關(guān)基因在組織分中布，卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，以及經(jīng)過(guò)蛻皮抑制激素（MIH）注射后相應(yīng)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。此外還選取了具有代表性的細(xì)胞周期蛋白B進(jìn)行了重組表達(dá)及免疫組化研究。
　　結(jié)果如下：
　　1）采用 RACE技術(shù)克隆得到一條全長(zhǎng)1706bp的細(xì)胞周期蛋白 E基因cDNA序列，并命名為PmcycE。該序列包含13

3、2bp的5’非編碼區(qū)（UTR）和311bp的3’非編碼區(qū)以及1263bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），可編碼420個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的分子量約為47.91kDa，理論等電點(diǎn)5.85。生物信息學(xué)軟件分析表明該氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守區(qū)并含有N-糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)，經(jīng)BLAST同源性分析發(fā)現(xiàn)，與Solenopsis invicta（紅火蟻），Megachile rotundata（切葉蜂）等多種節(jié)肢動(dòng)物有很高的同源性。熒光

4、定量PCR顯示，該基因在斑節(jié)對(duì)蝦精巢，卵巢，腸，腦，肝胰腺，胃和心等各組織中均有表達(dá)，在卵巢和眼柄中表達(dá)量明顯高于其他組織，心臟，胃及肝胰腺表達(dá)量相對(duì)較低。分別對(duì) MIH注射和眼柄切除的對(duì)蝦進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)眼柄切除切除后，細(xì)胞周期蛋白 E大量表達(dá)，而注射MIH后細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)量相對(duì)降低。
　　2)采用RACE技術(shù)克隆得到一條全長(zhǎng)1280bp的細(xì)胞周期蛋白H基因cDNA序列，并命名為PmcycH。該序列包含63bp的5’非編

5、碼區(qū)（UTR）和218bp的3’非編碼區(qū)以及999bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），可編碼332個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的分子量約為39kDa，理論等電點(diǎn)6.39。利用BLAST及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示該P(yáng)mcycH屬于細(xì)胞周期蛋白H家族。熒光定量PCR顯示，該基因在斑節(jié)對(duì)蝦精巢，卵巢，腸，腦，肝臟，胃，肌肉和心等各組織中均有表達(dá)，在卵巢中表達(dá)量明顯高于其他組織，心臟，腦及肝臟表達(dá)量相對(duì)較低。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量的方法發(fā)現(xiàn)，PmcyclinH在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢的不

6、同發(fā)育時(shí)期的分布并不相同，表明 PmcyclinH與細(xì)胞周期調(diào)控及卵巢發(fā)育有關(guān)。
　　3)設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物從斑節(jié)對(duì)蝦的卵巢cDNA中克隆出周期蛋白B的開(kāi)放閱讀框（ORF），并與PET-21a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功獲得周期蛋白 B的重組蛋白并以該重組蛋白為抗原送公司設(shè)計(jì)抗體（命名為R-CYCB）。
　　4）取經(jīng)過(guò)MIH注射處理（參照組）及未經(jīng)過(guò)MIH處理（實(shí)驗(yàn)組）的斑節(jié)對(duì)蝦卵巢組織制備石