集成化微流控芯片的研制及其在大腸埃希菌O157-H7檢測中的應(yīng)用.pdf

1、研究目的：
　　在病原菌快速檢測微流控芯片中引入微閥微通道大規(guī)模集成技術(shù),研制一種集成多通道和多組氣閥的集成化微流控芯片,利用集成化微流控芯片操作的并行性優(yōu)勢實現(xiàn)高通量、自動化、低成本、快速檢測大腸埃希菌O157:H7。
　　研究方法：
　　1、研制集成化微流控芯片自動化反應(yīng)系統(tǒng):采用autoCAD2007軟件設(shè)計集成化微流控芯片CAD圖片;采用模塑法和多層軟光刻技術(shù)制作集成化PDMS微流控芯片;組裝單片機、電磁閥等電

2、子器件,研制本芯片專用的微閥控制器;將制備好的微流控芯片以及氣閥控制器與注射器、注射泵、熒光倒置顯微鏡和CCD等設(shè)備連接起來,搭建自動化的集成化微流控芯片反應(yīng)系統(tǒng)。
　　2、研究集成化微流控芯片的最佳表面修飾及抗體固定方法:以玻片為載體,對物理吸附、直接共價結(jié)合及共價結(jié)合與親和結(jié)合聯(lián)用三種抗體固定方法進(jìn)行系統(tǒng)性對比研究:通過單因素試驗優(yōu)化各反應(yīng)的最佳反應(yīng)參數(shù);在最佳反應(yīng)條件下,比較物理吸附及直接共價結(jié)合方法固定蛋白質(zhì)的效率,從中篩

3、選出固定蛋白分子效率最高的表面修飾方法;以篩選出的最佳表面修飾方法為基礎(chǔ),將蛋白 G和鏈霉親和素分別固定在芯片內(nèi),比較此兩種親和定向固定方法保持抗體活性的能力,從中篩選出保持抗原結(jié)合能力最高的抗體固定方法,最終確定最佳的抗體固定方法。
　　3、建立基于集成化微流控芯片的大腸埃希菌O157:H7檢測體系并初步應(yīng)用:以集成化微流控芯片自動化反應(yīng)系統(tǒng)為平臺,以最佳抗體固定方法固定抗體,在芯片通道交叉處構(gòu)建出10個檢測單元。在此基礎(chǔ)上,以

4、免疫熒光技術(shù)為檢測手段,建立基于集成化微流控芯片的大腸埃希菌O157:H7快速檢測方法并將此方法初步應(yīng)用于礦泉水、牛奶及糞便模擬污染樣品的檢測。
　　研究結(jié)果：
　　1、成功研制了集成有40個氣動微閥及11條微通道的集成化微流控芯片,以及配套的微閥控制器。并以此芯片為反應(yīng)單元;以氣動微閥控制器為控制中心;以十通道注射泵為動力源;以常規(guī)熒光倒置顯微鏡和CCD為檢測器,成功搭建了一套集成化微流控芯片自動化反應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過微閥

5、控制器即可簡單、快速、便捷地同時控制微流控芯片內(nèi)11條通道的開關(guān)。
　　2、在反應(yīng)條件為:5％硫醇在60℃下反應(yīng)1h,2mg/mL馬來酰胺室溫下反應(yīng)30min時,玻片上的固定蛋白熒光信號最強;在反應(yīng)條件為:1mg/mL鏈霉親和素(SA)在室溫下反應(yīng)1h,10ug/mL生物素修飾的捕獲抗體室溫下固定30min時,玻片上的固定抗體熒光信號最強,細(xì)菌捕獲率最高。
　　3、在反應(yīng)條件為:進(jìn)樣速度及時間分別為1μL/min和30min

6、,檢測抗體濃度及反應(yīng)時間分別為50ug/mL和30min時,基于集成化微流控芯片系統(tǒng)檢測大腸埃希菌O157:H7的檢測通量為10樣本/次,總檢測時間和試劑耗量為1h和5μL,對大腸埃希菌O157:H7的最低檢測限為1.6×103 CFU/mL,與大腸埃希菌ATCC25922及傷寒沙門菌ATCC14028無交叉反應(yīng),批內(nèi)精密度為5.2%。將本法初步應(yīng)用于礦泉水、牛奶及糞便懸液模擬污染樣品中大腸埃希菌 O157:H7的測定,檢測敏感度分別為

7、92%、78%和62%,檢測特異度均為100%,與培養(yǎng)金標(biāo)法的總體符合率均>80%,Kappa值顯示本方法與金標(biāo)法一致性較好。
　　結(jié)論：
　　1、通過多層軟光刻工藝可制作高度集成的微流控芯片;通過組裝單片機和電磁閥可制作專用的芯片控制器;基于集成化微流控芯片自動化反應(yīng)系統(tǒng)可實現(xiàn)并行高通量運行及流體操作的自動化,具有很好的可行性和靈活的操作性。
　　2、巰基-馬來酰亞胺基團(tuán)硅烷化法固定蛋白質(zhì)的效率比物理吸附法、氨基硅烷