Micro RNA在原發(fā)免疫性血小板減少癥發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分
　　 實驗背景與目的：
　　 原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種自身免疫性出血性疾病，其發(fā)病機制復雜。目前認為ITP的發(fā)病是一個多步驟，多細胞參與的過程。MicroRNA(miRNAs)是一類非編碼單鏈小分子RNA，它能夠通過特異性的堿基配對抑制靶mRNA翻譯或誘導剪切，從而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控。MiRNAs的功能涉及多種生物學

2、過程，與細胞分化、器官形成、腫瘤發(fā)生等密切相關。近年來研究發(fā)現，miRNAs在免疫系統(tǒng)中扮演了重要作用，它參與免疫細胞的發(fā)育，同時能調節(jié)獲得性免疫和天然免疫反應，因而miRNA參與了類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和實驗性自身免疫性腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生。鑒于miRNA在免疫細胞分化、免疫應答及其他自身免疫性疾病方面的研究成果，我們推測miRNAs在ITP發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要的作用。因而為了闡明miRNAs在ITP發(fā)病中的作用，

3、我們開始了此項研究。
　　 方法：
　　 (1)收集24例ITP病人及20例正常對照外周血標本，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個核細胞(PBMCs)；
　　 (2)選取3例ITP病人及3倒正常對照，以他們的PBMCs為研究對象，采用microRNA芯片技術初步篩選差異表達的miRNAs；
　　 (3)采用Taqman實時定量PCR的方法對芯片結果進行大樣本驗證；
　　 (4)采用Real-ti

4、me RCR的方法檢測miRNAs加工蛋白Dicer、Drosha、DGCR8和Ago2的mRNA表達水平。
　　 結果：
　　 MiRNAs芯片結果顯示：有8個顯著上調的miRNAs和12個顯著下調的miRNAs。進一步Taqman實時定量PCR的驗證結果顯示：miRNA-130a(p=0.008)，miR-409-3p(p=0.01)和miR-28-5p(p=0.048)在ITP患者PBMCs中明顯低表達，但尚未發(fā)現

5、表達上調的miRNAs。另外，miRNAs加工蛋白DGCR8在ITP病人PBMCs內的表達明顯下調(p=0.045)，而Dicer、Drosha和Ago2的表達與正常對照相比無明顯差異。進一步的相關性分析結果顯示，這些miRNAs加工相關蛋白的表達明顯正相關。
　　 結論：
　　 MiR-130a，miR-409-3p和miR-28-5p在ITP病人PBMCs內低表達，推測這種低表達可能是由于DGCR8表達下調導致miR

6、NAs加工受損所造成。上述結果說明miRNAs可能參與ITP疾病的發(fā)生，但具體的作用機制還需要進行進一步的研究。
　　 第二部分
　　 研究背景：
　　 原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic purpura，ITP)是一種以外周血血小板數量減少和皮膚粘膜出血為主要臨床表現的器官特異性自身免疫性疾病。根據microRNAs(miRNAs)在免疫細胞分化，免疫應答和自身免疫性疾病等方

7、面的研究成果，我們推測miRNAs在ITP發(fā)病中起一定的作用。在前一部分研究中，我們發(fā)現microRNA-130a(miR-130a)在ITP病人PBMCs內低表達，說明它參與ITP疾病的發(fā)生。以往研究發(fā)現，miR-130a是一個多效性miRNA，它能通過調節(jié)水通道蛋白4、雌激素受體α和MET原癌基因等靶基因參與肺癌、腦水腫等多種疾病的發(fā)生。然而，對于miR-130a在免疫系統(tǒng)中的作用尚不清楚。因而為了進一步闡明miR-130a在ITP

8、發(fā)病機制中的作用，提出此研究。
　　 方法：
　　 (1)通過生物信息學分析預測miR-130a的靶基因。
　　 (2)采用雙熒光報告體系及miRNAs與靶基因3’非翻譯區(qū)結合位點定位點突變的方法驗證生物信息學的預測結果。
　　 (3)通過電穿孔的方法向ITP病人外周血單個核細胞(PBMCs)內轉染pre-miR-130a或anti-miR-130a，使其過表達或沉默miR-130a。
　　 (4

9、)通過ELISA方法檢測轉染后細胞培養(yǎng)上清或血漿中TGF-β1和IL-18的蛋白表達水平，同時用實時定量PCR的方法檢測TGF-β1和IL-18的mRNA表達水平。
　　 (5)用Taqman實時定量PCR的方法檢測與TGF-β1共培養(yǎng)的細胞中miR-130a的表達，觀察TGF-β1對miR-130a表達的影響。
　　 (6)對同一個ITP病人于入院及血小板穩(wěn)定后兩個時間點取樣，檢測PBMCs內miR-130a的表達及血

10、漿中靶基因TGF-β1和IL-18的濃度。
　　 結果：
　　 通過生物信息學的方法和雙熒光報告載體的進一步驗證，確定TGF-β1和IL-18為miR-130a的靶基因。之后轉染pre-miR-130a使其過表達之后，TGF-β1和IL-18 mRNA及蛋白的表達受到抑制(p均小于0．05)。反之，沉默miR-130a之后，TGF-β1和IL-18 mRNA及蛋白的表達水平上調(p均小于0.05)。同時，培養(yǎng)的PBMCs

11、內加入外源性的TGF—β1能促進miR-130a的表達(p=0．046)，說明它們之間存在相互調節(jié)的循環(huán)。進一步對ITP病人于入院及血小板穩(wěn)定后兩個時間點取樣，檢測miR-130a及靶基因表達的動態(tài)變化。結果顯示，隨著疾病的緩解，miR-130a(p=0.036)和TGF-β1(p=0．015)的表達上調，同時IL-18的表達下調(p=0．028)。
　　 結論：
　　 MiR-130a通過調節(jié)靶基因TGF-β1和IL-