不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系的microRNA和基因表達(dá)譜研究.pdf

1、目的與背景：
　　 應(yīng)用Affymetrix公司芯片技術(shù)對不同轉(zhuǎn)移能力的卵巢癌細(xì)胞系的microRNA表達(dá)譜及其基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，并對其中的某些microRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測，來探討卵巢癌轉(zhuǎn)移過程microRNA對其轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用Affymetrix公司microRNA芯片技術(shù)來檢測不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系的microRNA表達(dá)譜
　　 2.應(yīng)用Affymetrix公司基

2、因外顯子芯片技術(shù)來檢測不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系的基因表達(dá)譜
　　 3.我們運(yùn)用半定量PCR方法對microRNA芯片及基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，分別以不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后得到let-7a、Hsa-miR-27a、Hsa-miR-181b、Hsa-miR-34a、CD44、MUC16的cDNA模板，利用特異性定量PCR引物，凝膠電泳，對這些microRNA和基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。
　　 4.實時

3、熒光定量PCR方法(qRT-PCR)對microRNA芯片及基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，分別以不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后得到let-7a、Hsa-miR-27a、Hsa-miR-181b、Hsa-miR-34a、CD44、MUC16的cDNA模板，利用SsoFast EvaGreen supermix和特異性定量PCR引物，對這些microRNA和基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。
　　 5.蛋白免疫印跡方法(Weste

4、rn-blot)對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，分別提取不同轉(zhuǎn)移能力卵巢癌細(xì)胞系總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、CD44抗體孵育，DAB染色，利用軟件對CD44蛋白的相對含量進(jìn)行分析。
　　 6.通過芯片結(jié)果、不同實驗方法的驗證結(jié)果及軟件分析，選擇與卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA及基因，并對其表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，預(yù)測microRNA對其表達(dá)調(diào)控的靶基因在卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中起到的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.microRNA芯片

5、結(jié)果顯示HO-8910PM與HO-8910相比(差異倍數(shù)>2/差異倍數(shù)<0.5)有15個顯著差異的microRNA，其中上調(diào)的有3個：miR-423-5p，miR-181band miR-122。下調(diào)的有12個：miR-25，miR-34a，miR-886-3p，miR-1274b，miR-27a，miR-15b，miR-29a，miR-19b，miR-130a，miR-210，miR-16，let-7a。
　　 2.基因芯片結(jié)

6、果顯示HO-8910PM與HO-8910相比(差異倍數(shù)>2/差異倍數(shù)<0.5)有191個顯著差異，其中101個基因顯著上調(diào)，90個基因顯著下調(diào)。
　　 3.半定量PCR、qRT-PCR及Western-blot方法分別驗證了不同的microRNA及基因，結(jié)果顯示microRNA芯片及基因芯片結(jié)果可靠。
　　 4.相關(guān)文獻(xiàn)顯示CD44與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過軟件分析及負(fù)相關(guān)分析結(jié)果顯示let-7a可能在CD44調(diào)控卵巢