人臍帶間充質干細胞移植治療大鼠梗阻性腎間質纖維化的實驗研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)和鑒定人UC-MSCs，觀察異種UC-MSCs靜脈移植的安全性及UC-MSCs在UUO大鼠體內的分布，探討人UC-MSCs移植治療梗阻性腎間質纖維化的可行性，分析UC-MSCs移植抗纖維化的可能機制，為臨床UC-MSCs移植治療慢性腎臟疾病提供理論和實驗依據。
　　 方法：
　　 1.無菌條件下取新鮮臍帶，采用聯合酶序貫消化法分離UC-MSCs，并通過傳代進行純化和擴增培養(yǎng)，觀察細胞的形態(tài)特點，繪制生長曲

2、線；進行細胞凍存和復蘇，觀察細胞的穩(wěn)定性；用流式細胞儀檢測UC-MSCs表面抗原；誘導向成骨、脂肪細胞分化以觀察其多項分化潛能。凍存的UC-MSC復蘇、擴增，調整細胞濃度為5×106/ml備用。
　　 2.8周齡雌性SD大鼠84只隨機分為4組，各21只：①單側輸尿管梗阻組(UUO組)：。大鼠行左側輸尿管結扎術，術后7d尾靜脈注射PBS1ml。②單側輸尿管梗阻+細胞移植組(UUO+MSCs組)：大鼠行左側輸尿管結扎術，術后7d尾靜

3、脈注射5×106UC-MSCs。③假手術組(Sham組)：手術入路方式同UUO組，進腹腔后分離左輸尿管但不結扎輸尿管，術后7d經尾靜脈注射PBS1ml。④假手術+細胞移植組(Sham+MSCs組)：手術入路方式同UUO組，進腹腔后分離左輸尿管但不結扎輸尿管，術后7d尾靜脈注射5×106UC-MSCs。四組大鼠分別于造模后14d、21d、28d共3個時間點各取7只殺鼠，造模后和殺鼠前均測量體重，殺鼠后收集血標本、腎臟、心臟、肝臟、脾臟和肺

4、，行以下檢查：①血標本檢測血常規(guī)、血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶；②四組大鼠腎組織均行蘇木精-伊紅(HE)、過碘酸希夫反應(PAS)和Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)學改變；③免疫組化染色檢測四組大鼠心、肝、脾、肺、腎組織MAB1281(標記人UC-MSCs)陽性表達細胞，光鏡下觀察并計數陽性細胞個數。
　　 3.8周齡雌性SD大鼠63只隨機分為UUO組、UUO+MSCs組和Sham組，每組各21只，模型的制備和細胞移

5、植的劑量同前。三組大鼠分別于造模后14d、21d、28d共3個時間點各取7只殺鼠，殺鼠后收集24小時尿液、血標本和腎臟，行以下檢查：①尿標本行24h尿蛋白含量檢測，血標本檢測血清尿素氮和肌酐水平；②三組大鼠腎組織光學顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)學改變，并對腎小管間質損害進行評分；③免疫組化染色檢測三組大鼠腎組織α-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的表達，光鏡下觀察陽性反應，測量黃色部分的累積光密度并計算平均光密度。④Western b

6、lot進一步檢測腎組織α-SMA、Fn、TGF-β1和BMP-7的蛋白定量，測量陽性條帶的光密度值并計算與β-tubulin的光密度比值。
　　 結果：
　　 1.經酶消化后的原代細胞多于24-48小時內貼壁，1周以后增長速度較快，呈平行排列生長或旋渦狀生長，于第2、3周可形成大于80％融合貼壁細胞層；凍存后復蘇的P4代細胞，生長速度較快，倍增時間均約為28h，細胞形態(tài)無明顯改變；P2代臍帶來源貼壁細胞成骨定向誘導14天

7、，可見細胞間布滿黑色顆粒，提示有礦化基質沉積，成脂肪定向誘導14天后，可見油紅-O染色呈強陽性；流式細胞儀細胞免疫表型檢測發(fā)現臍帶源貼壁細胞表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等MSCs標記物，不表達造血細胞標記CD34、CD45，不表達內皮細胞標記CD31和HLA-DR。
　　 2.各時間點Sham+MSCs組的體重增長、血常規(guī)、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶水平與Sham組比較差異沒有顯著性意義(P>0.05)。②

8、UUO組和UUO+MSCs組結扎側腎臟隨時間的延長，間質纖維化程度逐步加重，腎小球無明顯病變。③四組大鼠心、肝、脾、肺大體標本肉眼觀察均無明顯異常。Sham+MSCs組心、肝、脾、肺、腎組織光鏡下未見明顯炎性細胞浸潤。④外源性的UC-MSCs主要分布在肺和脾臟，其次是腎臟和心肌，肝臟幾乎沒有。UUO+MSCs組脾臟的UC-MSCs明顯少于Sham+MSCs組(P<0.01)，但腎臟的UC-MSCs卻多于Sham+MSCs組，而且UUO+

9、MSCs組的左腎UC-MSCs主要分布在腎間質，Sham+MSCs組的腎臟UC-MSCs卻主要分布在腎小球。
　　 3.①各時間點三組間24h尿蛋白排出量無顯著性差異(P>0.05)。術后第14天，UUO+MSCs組與UUO組相比，血肌酐值下降，差異有顯著性意義(P<0.05)。②術后14天和21天，UUO+MSCs組大鼠腎小管間質的病理積分、腎組織Fn和α-SMA免疫組化平均光密度和蛋白表達均低于UUO組(P<0.05)，但術

10、后28天兩組間無明顯差異(P>0.05)。③術后第14天和28天，與UUO組相比，UUO+MSCs組腎組織TGF-β1免疫組化平均光密度和蛋白表達均減少，但BMP-7平均光密度和蛋白表達增多(P<0.05)。④腎組織中α-SMA的表達與TGF-β1的表達呈正相關，而與BMP-7的表達呈負相關。
　　 結論：
　　 1.聯合酶序貫消化法能成功分離人UC-MSCs，經傳代、凍存復蘇后的細胞特性無明顯改變。培養(yǎng)的細胞具有MSC