血紅素加氧酶-1對大鼠肝纖維化及肝星狀細胞增殖、活化與凋亡的調(diào)控作用研究.pdf

1、肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理學基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，也是臨床治療慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其組織學特征表現(xiàn)為以膠原為主的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分合成增多、降解相對不足而在肝內(nèi)過量沉積。肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)是產(chǎn)生ECM的主要來源，HSC的增殖活化是肝纖維化發(fā)生的中心事件。通過抑制HSC增殖、誘導HSC凋亡來阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，是抗肝纖維化治療

2、的重要策略。
　　 血紅素加氧酶-1(HemeOxygenase-1，HO-1)是人類和哺乳動物組織中廣泛存在的一種加氧酶，是催化血紅素的起始酶和限速酶。HO-1及其催化產(chǎn)物一氧化碳(CarbonMonoxide，CO)、膽紅素及轉(zhuǎn)鐵蛋白在體內(nèi)有顯著的抗炎、抗氧化、調(diào)控細胞凋亡等重要作用。有研究顯示，HO-1在肝移植、急性肝損傷和缺血再灌注損傷等多種肝臟損害中，對肝細胞均具有保護作用。在慢性肝病進展過程中誘導HO-1表達，可以減

3、少I型膠原的分泌，有效阻止肝纖維化的進展。
　　 過氧化物酶體增生因子激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其亞型PPARγ主要分布于HSC。在肝纖維化進展過程中，上調(diào)PPARγ表達可以抑制HSC激活、誘導HSC凋亡，進而減輕肝纖維化的程度。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerof

4、activatedBcells，NF-κB)是具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，活化的NF-κB可促進HSCs增殖及膠原的產(chǎn)生、誘導TNF-a、IL-6及TGF-β等相關(guān)細胞因子與纖維化因子的釋放、并減少HSCs凋亡，在促進在肝纖維化進程中同樣發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可以直接與NF-κB的亞基p50/p65結(jié)合，或通過競爭結(jié)合協(xié)同活化因子p300和CBP來抑制NF-κBDNA合成、轉(zhuǎn)錄與表達，誘導HSC的凋亡。對肝纖維化發(fā)生、發(fā)展起重

5、要的負調(diào)控作用。
　　 已有其他領(lǐng)域的研究顯示，HO-1同PPARγ之間存在相互調(diào)控，HO-1啟動子區(qū)的基因多態(tài)性影響PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性；HO-1的啟動子區(qū)域還有NF-κB結(jié)合位點，誘導HO-1表達可以抑制NF-kB、TNF-α及IL-6等相關(guān)細胞因子的分泌。
　　 有關(guān)HO-1對肝臟保護機制的研究目前主要集中于HO-1的分解產(chǎn)物如膽綠素、一氧化碳(CO)和自由鐵的抗氧化及抗炎作用等方面，而HO-1對肝纖維化相關(guān)信號分

6、子調(diào)控方面的研究尚未見報道。為此，本課題從在體動物實驗和體外細胞實驗兩方面入手，觀察HO-1的表達對大鼠肝纖維化及HSC-T6增殖、活化與凋亡的影響，同時研究HO-1表達對HSC-T6中PPARγ、NF-kB及其下游炎性信號分子與凋亡相關(guān)因子表達的影響，以進一步探討HO-1調(diào)控HSC-T6增殖、活化及凋亡，進而阻止肝纖維化進展的信號分子機制。
　　 本課題包括以下三部分：
　　 第一部分:血紅素加氧酶-1對大鼠肝纖維化及

7、相關(guān)信號分子表達的影響。
　　 第二部分:血紅素加氧酶-1對大鼠肝星狀細胞增殖、活化及凋亡的影響。
　　 第三部分:血紅素加氧酶-1對大鼠肝星狀細胞調(diào)控作用的信號分子機制。
　　 第一部分:
　　 血紅素加氧酶-1對大鼠肝纖維化及相關(guān)信號分子表達的影響。
　　 目的：
　　 研究在構(gòu)建實驗性肝纖維化大鼠模型的過程中抑制/誘導HO-1的表達對大鼠肝纖維化進程及相關(guān)信號分子表達的影響。

8、　　 方法：
　　 采用復合因素構(gòu)建肝纖維化大鼠模型。實驗分組：正常對照組,4周模型組，6周模型組，ZnPP-Ⅸ干預組，Hemin干預組。在造模第4～6周分別給予HO-1的誘導劑Hemin及抑制劑Znpp-Ⅸ隔日腹腔注射進行干預。HE、Masson染色觀察肝臟病理組織學變化；免疫組織化學染色觀察肝組織中HO-1及α-SMA的分布與表達；全自動生化分析儀檢測血清各項生化指標；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中透明質(zhì)酸(HA

9、)及Ⅲ型前膠原(PⅢP)水平；分光光度法檢測組織中羥脯氨酸(Hyp)含量；采用Real-timePCR技術(shù)檢測肝組織中α-SMA、HO-1、PPARy及NF-κB的mRNA表達；采用Westemblot技術(shù)檢測肝組織中HO-1、PPARy及NF-κBp65的蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、HE及Masson染色結(jié)果表明肝纖維化模型構(gòu)建成功。Hemin干預組膠原纖維的增生、肝小葉的破壞及假小葉的形成程度明顯低于同期模型

10、組及Znpp-Ⅸ干預組（P＜0.05）：
　　 2、免疫組織化學染色及Real-timePCR、Westernblot檢測各實驗組大鼠肝臟HO-l表達的結(jié)果顯示：隨著造模時間延長，纖維化肝組織中HO-1表達范圍擴大且強度增加(P＜0.01);Hemin干預組HO-1表達范圍及強度較對照組及模型組增加更加明顯（P＜0.01），而Znpp-Ⅸ干預組HO-1表達強度則減弱（P＜0.01）：
　　 3、免疫組織化學染色及Real

11、-timePCR檢測大鼠肝臟α-SMA表達的結(jié)果顯示：肝纖維化進展過程中肝組織中α-SMA表達逐漸增加，Hemin的干預使α-SMA的表達明顯下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預組α-SMA的表達則增加（P＜0.05）；
　　 4、各實驗組大鼠肝臟生化指標的變化：大鼠肝功能的損害程度隨肝纖維化的進展而逐漸加重（P＜0.05）；Hemin干預組ALT、AST、ALB及TBIL各項生化指標較同期模型組及Znpp-Ⅸ干預組則明顯恢復

12、（P＜0.05）；
　　 5、各實驗組大鼠肝臟膠原代謝的變化：大鼠血清HA、PⅢP及肝組織中Hyp含量隨著肝纖維化程度的加重而逐漸增加（P＜0.05），Hemin的干預使HA、PⅢP及Hyp含量較同期模型組及Znpp-Ⅸ干預組明顯下降（P＜0.05）：
　　 6、Real-timePCR及Westemblot檢測各實驗組大鼠肝組織中PPARγmRNA及蛋白表達顯示：隨著肝纖維化程度的加重，肝組織內(nèi)PPARγ的mRNA表達

13、逐漸下降（P＜0.01），使用Znpp-Ⅸ的干預組同6周模型組相比雖無統(tǒng)計學意義，但仍有下降趨勢（P=0.195）；而Hemin干預組PPARγ的mRNA表達則較6周模型組明顯增加（P＜0.05）。PPARγ蛋白表達與mRNA變化趨勢一致；
　　 7、Real-timePCR及Westernblot檢測各實驗組大鼠肝組織中NF-κBmRNA及蛋白表達顯示：隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中NF-κB的mRNA表達逐漸增加（P＜0.

14、01）；Znpp-Ⅸ干預組較6周模型組增加更為明顯（P＜0.05），而Hemin干預組中的NF-κBmRNA表達則顯著下降(P＜0.05)。NF-κB蛋白表達與mRNA變化趨勢一致。
　　 結(jié)論：
　　 HO-1的誘導表達可以明顯減輕肝纖維化大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)程度、降低肝組織α-SMA及膠原纖維的表達，減輕肝纖維化：而HO-1阻止肝纖維化進展的肝臟保護作用可能是通過對肝組織中PPARγ及NF-κB表達的調(diào)控實現(xiàn)的。

15、>　　 第二部分：
　　 血紅素加氧酶-1對大鼠肝星狀細胞增殖、活化及凋亡的影響
　　 目的：
　　 研究抑制/誘導HO-1的表達對HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響。
　　 方法：
　　 以活化的HSC-T6為研究對象。不同濃度的Hemin(10μmol/1,20μmol/1、40μmol/1)及Znpp-Ⅸ(5μmol/1、10μmol/1、20μmol/1)作用于HSC-T6不同的時間(1

16、2h，24h,48h)，通過MTTLk色法檢測HSC-T6的增殖情況、臺盼藍拒染實驗觀察細胞存活率及乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗觀察藥物對細胞的毒性作用，以此篩選出Hemin或Znpp-Ⅸ發(fā)揮誘導/抑制HO-1表達效應(yīng)的最適濃度及作用時間用于后續(xù)實驗。實驗分組：空白對照組、Hemin干預組、Znpp-Ⅸ干預組及Hemin+Znpp干預組。采用MTT法檢測各實驗組HSC-T6的增殖情況；ELISA方法檢測HSC-T6上清液中HA及PⅢP含

17、量；免疫細胞化學技術(shù)檢測HSC-T6中HO-1及α-SMA的分布與表達；Real-timePCR檢測HSC-T6中HO-1及α-SMA的mRNA表達；Westernblot檢測HSC-T6中HO-1及α-SMA蛋白表達；TUNEL法及AnnexinV-FITC/PI聯(lián)合標記流式細胞術(shù)檢測HSC-T6的凋亡：Real-timePCR檢測HSC-T6中抗凋亡蛋白Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達。
　　 結(jié)果：
　　

18、 1、HO-1的誘導劑Hemin對HSC-T6增殖發(fā)揮抑制作用且無明顯細胞毒性的最適濃度為20μmol/1（13μg/ml）。抑制劑ZnPP-Ⅸ對HSC-T6增殖發(fā)揮促進作用且無明顯細胞毒性的最適濃度為10μmol/l（3μg/ml），作用時間選擇24h;
　　 2、免疫細胞化學技術(shù)、Real-timePCR及Westernblot對各組HSC-T6中HO-1表達的檢測顯示：Hemin干預組的HO-1表達范圍及強度較正常對照及

19、其他干預組均顯著升高(P＜0.01);Znpp-Ⅸ干預組同對照組相比雖無顯著差異，但也呈下降趨勢；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干預組中HO-1的表達范圍及強度較單純Hemin干預組顯著下降（P＜0.05）；
　　 3、免疫細胞化學技術(shù)、Real-timePCR及Westernblot對各組HSC-T6中α-SMA表達的檢測顯示：Hemin干預組可見α-SMA表達范圍及強度較對照組顯著下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預組則升高

20、（P＜0.01）；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干預組α-SMA表達范圍及強度較單純Hemin干預組增加（P＜0.01）；
　　 4、各實驗組HSC-T6增殖情況：Hemin干預組HSC-T6的增殖活性（MTT值0.867±0.023）較對照組下降16.15～（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ組（MTT值為1.161±0.015）較對照組升高12.28％(P＜0.01)；Hemin+Znpp-Ⅸ組則比Hemin單獨處理組HSC-T6增

21、殖活性升高（P＜0.05）；
　　 5、各實驗組HSC-T6膠原代謝的變化：Hemin干預組細胞上清液中HA及PⅢP含量較對照組顯著下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預組二者均顯著升高（P＜0.01），而Hemin+Znpp-Ⅸ干預組細胞上清液中HA及PⅢP含量較單純Hemin干預組升高（P＜0.01）：
　　 6、TUNEL及AnnexinV-FITC/Pl流式細胞術(shù)檢測各組HSC-T6的凋亡：TUNEL結(jié)果顯示：H

22、emin干預組HSC-T6凋亡指數(shù)(23.5％±2.02％)較對照組（3.25％±0.63％）增加了6.23倍（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預組（4.00％±0.82％）同對照組相比無顯著差異（P=0.574）；而Hemin+Znpp-Ⅸ組凋亡指數(shù)(16.25％±1.38％)則較單純Hemin干預組下降（P＜0.01）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果同上述趨勢一致；
　　 7、Real-timePCR檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Caspa

23、se-3的mRNA表達顯示：同對照組相比較Hemin干預組Bcl-2mRNA表達顯著下降（P＜0.05），Caspase-3mRNA表達升高（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預組Bcl-2mRNA升高（P＜0.05），而Caspase-3mRNA表達下降；Hemin及Znpp-Ⅸ共同干預組中Bcl-2mRNA表達量較單純Hemin干預組又有所回升(P＜0.05)，而Caspase-3mRNA的表達則有所下降（P＜0.05）。
　　

24、 結(jié)論：
　　 HO-1的誘導表達能夠抑制HSC-T6的增殖活性及膠原蛋白的代謝能力；HO-1還能夠通過影響凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2及Caspase-3的表達來調(diào)控HSC-T6的凋亡。
　　 第三部分：
　　 血紅素加氧酶-1對大鼠肝星狀細胞調(diào)控作用的信號分子機制
　　 目的：
　　 研究抑制/誘導HO-1表達對HSC-T6內(nèi)PPARγ、NF-κB及下游炎性細胞因子表達的調(diào)控作用。
　　

25、方法：
　　 實驗分組為空白對照組、Hemin干預組、Hemin+GW9662組、Znpp-Ⅸ干預組、Znpp-Ⅸ+羅格列酮組。采用免疫細胞化學技術(shù)檢測PPARγ在HSC-T6中的表達；免疫熒光技術(shù)檢測NF-κBp65在HSC-T6中的表達；Realtime-PCR技術(shù)檢測HSC-T6中HO-1、PPARγ及NF-κB的mRNA表達：Westemblot檢測HSC-T6中HO-1、PPARy及NF-κBp65的蛋白表達；采用EL

26、ISA方法檢測各實驗組HSC-T6培養(yǎng)上清液中TGF-β1及IL-6的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1、Real-timePCR及Westemblot檢測各組HSC-T6中HO-1的mRNA及蛋白表達：Hemin干預組HO-1表達較對照組明顯增加（P＜0.01）；Hemin+GW9662組HO-1的mRNA表達較單純Hemin干預組下降19.96％（P＜0.05），蛋白表達下降16.05％（P＜0.05）；Znpp-Ⅸ干預

27、組HO-1表達較對照組明顯下降（P＜0.01）；而Znpp-Ⅸ+羅格列酮組，HO-1的mRNA表達較單純Znpp-Ⅸ干預組升高18.32％（P＜0.05），蛋白表達升高13.7％（P＜0.05）：
　　 2、Real-timePCR及Westernblot檢測各組HSC-T6中PPARγ、NF-κBp65的mRNA及蛋白表達：Westernblot結(jié)果顯示：Hemin干預組PPARγ表達較對照組升高（P＜0.01），NF-κBp

28、65表達則下降（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預組PPARγ表達較對照組下降（P＜0.01），而NF-κBp65表達升高(P＜0.01)。Hemin+GW9662同單純Hemin組比較PPARγ表達下降17.78％、NF-κB的表達則升高28.94％（p＜0.05）：Znpp-Ⅸ+羅格列酮組同單純Znpp-Ⅸ組比較PPARγ表達升高18.6％、NF-κB蛋白表達則下降23.16％(p＜0.01)。Real-timePCR的mRNA檢測同

29、上述趨勢基本一致；
　　 3、免疫細胞化學及免疫熒光檢測HSC-T6中PPARγ.NF-κBp65的表達：PPARγ及NF-κBp65主要定位于HSC-T6細胞核。對照組細胞核PPARγ表達微弱；Hemin干預后細胞核PPARγ表達明顯增強，而應(yīng)用GW9662預孵育的實驗組PPARγ表達則較單純Hemin干預組減弱；Znpp-Ⅸ干預組HSC-T6細胞核中PPARγ表達較對照組下降，使用誘導劑羅格列酮預孵育的實驗組則可看到PPAR

30、γ表達較單純Znpp-Ⅸ干預組略有增加。而NF-κBp65的免疫熒光檢測結(jié)果則同PPARγ變化趨勢相反；
　　 4、各實驗組HSC-T6培養(yǎng)上清液中TGF-β1及IL-6的含量：ELISA檢測結(jié)果顯示，TGF-β1及IL-6在各組的變化趨勢一致。Hemin干預組細胞上清液中TGF-β1及IL-6的釋放量較對照組明顯下降(P＜0.01)，Hemin+GW9662組則觀察到二者較單純Hemin組均有所增加（P＜0.05）；Znpp-