核仁素在血管新生中的作用及其機制初步探討.pdf

1、血管新生是一個復雜的生物學過程，但其具體機制目前尚未完全明了。核仁素是一種具有多種生物學功能，在真核生物中高度保守的核仁磷酸蛋白，也是一種重要的RNA結合蛋白，具有在核仁、胞核、胞漿，甚至細胞膜表面穿梭的特性。大量研究表明，細胞膜表面核仁素參與血管新生的調節(jié)。然而，核仁素的RNA結合特性在血管新生中有何作用，目前仍不清楚。本研究在明確核仁素對血管新生起調節(jié)作用后，擬初步探討其RNA結合特性在血管新生中的作用及其可能的機制。
　　本

2、實驗首先通過建立小鼠心肌缺血模型，利用免疫組化和免疫熒光技術觀察血管新生和核仁素的表達，并采用PCR和WesternBlot技術檢測血管新生相關基因和核仁素的表達。其次，在細胞水平，建立VEGF誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)發(fā)生細胞遷移和管型形成的模型，采用增加和降低核仁素表達的研究手段，探討核仁素在VEGF誘導內皮細胞遷移和管型形成中的作用;同時利用PCR和WesternBlot技術觀察血管新生相關基因的表達情況。最后利用蛋白質-

3、RNA免疫共沉淀技術探討血管新生中核仁素可能調控的相關靶基因，以闡明核仁素在血管新生中發(fā)揮作用的可能機制。
　　主要實驗結果如下:
　　1.整體動物實驗。
　　(1)免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn):心肌缺血后15天，缺血組心肌組織中核仁素和血管內皮鈣粘蛋白表達升高，與假手術組比，具有統(tǒng)計學意義。
　　(2)PCR和WesternBlot技術檢測顯示:缺血組心肌組織中核仁素和血管新生相關基因表達升高，與假手術組比，差異

4、具有統(tǒng)計學意義。
　　(3)HE染色顯示核仁素轉基因小鼠血管密度明顯增高，免疫組化、PCR和WesternBlot技術檢測顯示血管新生相關基因表達升高，與野生型小鼠相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.細胞實驗。
　　(1)PCR和WesternBlot技術檢測顯示VEGF可誘導HUVEC核仁素表達升高，并在一定程度上呈時間和濃度依賴性。
　　(2)核仁素過表達能促進VEGF誘導的HUVEC發(fā)生細胞遷移和管型形成;

5、反之，siRNA介導的核仁素低表達則能抑制VEGF誘導的HUVEC發(fā)生細胞遷移和管型形成。
　　(3)生物信息學分析顯示多個血管新生相關基因如VE-cadherin，Tie-2，MMP9，Endoglin，COX43等的mRNA含有一個或多個核仁素的結合元件。
　　(4)PCR和WesternBlot技術檢測顯示siRNA介導的核仁素低表達能抑制血管新生相關基因的表達。
　　(5)利用蛋白質-RNA免疫沉淀技術，發(fā)現(xiàn)核