皮膚源性前體細胞體外分化與細胞體內(nèi)移植延緩失神經(jīng)肌肉萎縮的實驗研究.pdf

1、第一部分:GFP轉(zhuǎn)基因大鼠皮膚源性前體細胞體外向神經(jīng)元樣細胞分化及表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的實驗研究
　　目的:研究從成體GFP轉(zhuǎn)基因大鼠背部皮膚分離、體外增殖皮膚源性前體細胞(skin-derived precursors，SKPs)的方法，并探討皮膚源性前體細胞的生物學特性。在體外條件下，將皮膚源性前體細胞誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，研究皮膚源性前體細胞以及誘導分化成神經(jīng)元樣細胞后神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達情況。
　　方法:從GFP轉(zhuǎn)基因大

2、鼠背側(cè)皮膚分離細胞后，在促分裂劑堿性成纖維細胞生長因子2(FGF2)和表皮生長因子(EGF)存在的條件下懸浮培養(yǎng)。行細胞標志物巢蛋白(nestin)，纖維連接蛋白（fibronectin），β-tubulinⅢ、Sox2、神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF）、微管相關蛋白2(microtubule associated protein2，MAP2)免疫熒光染色和流式細胞儀檢測。傳3代后，皮膚源性前體細胞經(jīng)含有神經(jīng)生長因子(NG

3、F)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)等的誘導分化劑誘導分化2-4周。分別在誘導分化前和誘導分化后3周時采用RT-PCR測定皮膚源性前體細胞和皮膚源性前體細胞體外向神經(jīng)元分化的細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達情況。
　　結果:大鼠皮膚源性前體細胞可采用從腦內(nèi)分離神經(jīng)干細胞相類似的方法從GFP大鼠背側(cè)皮膚獲得。所獲得并體外增殖形成的細

4、胞神經(jīng)干細胞標志物巢蛋白(nestin)染色陽性，神經(jīng)元標志物β-tubulinⅢ陽性。皮膚源性前體細胞還表達一種骨髓間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白，但卻不表達神經(jīng)嵴干細胞標志物p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)以及多唾液酸-神經(jīng)細胞黏附分子(PSA-NCAM)。皮膚源性前體細胞可以同時表達巢蛋白和纖維連接蛋白(fibronectin)。傳3代后，仍有60％以上的細胞呈現(xiàn)巢蛋白染色陽性。分別從成體表皮、真皮和坐骨神經(jīng)分離獲得細胞在相同

5、培養(yǎng)條件下，僅有真皮中分離出細胞能增殖、懸浮生長并成球，并且也同時表達巢蛋白和纖維連接蛋白。皮膚源性前體細胞經(jīng)體外培養(yǎng)前就已經(jīng)存在于真皮組織中。皮膚源性前體細胞與間充質(zhì)干細胞不同，表現(xiàn)在皮膚源性前體細胞不表達波形蛋白(vimentin)和細胞角蛋白(cytokeratin)。皮膚源性前體細胞可被誘導分化為皮膚組織中原本并不存在的神經(jīng)元樣細胞，nestin、β-tubulinⅢ、神經(jīng)絲（neurofilament，NF）和微管相關蛋白2(

6、microtubule associatedprotein2，MAP2)免疫熒光染色陽性。無論皮膚源性前體細胞或其誘導分化成的神經(jīng)元樣細胞在體外環(huán)境中均表達神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。
　　結論:皮膚源性前體細胞是一種內(nèi)源性的前體細胞。可同時表達巢蛋白和纖維連接蛋白的皮膚源性前體細胞可從成體真皮組織中獲得，其與間充質(zhì)于細胞有本質(zhì)區(qū)別。在特定條件下，皮膚源性前體細胞可被誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，表達成熟神經(jīng)元標志

7、物。皮膚源性前體細胞及其誘導分化成的神經(jīng)元樣細胞均能表達神經(jīng)營養(yǎng)因子。皮膚源性前體細胞代表了一種新型的易獲得、可增殖、可誘導成神經(jīng)元樣細胞的干細胞。
　　第二部分:皮膚源性前體細胞在周圍神經(jīng)內(nèi)存活及皮膚源性前體細胞體外誘導分化為神經(jīng)元樣細胞在周圍神經(jīng)內(nèi)存活的實驗研究
　　目的:研究皮膚源性前體細胞和皮膚源性前體細胞體外誘導分化的神經(jīng)元樣細胞體內(nèi)移植，移植時機、移植周圍微環(huán)境對移植細胞存活率的影響，以及移植細胞在損傷的周圍神經(jīng)

8、中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達情況。
　　方法:根據(jù)可能導致細胞生存微環(huán)境改變的因素，將受體模型Lewis大鼠隨機分為脛神經(jīng)未損傷組和脛神經(jīng)損傷組。將建立周圍神經(jīng)損傷模型的Lewis大鼠脛神經(jīng)在其進入腓腸肌以上1厘米處橫斷，并造成0.5厘米的神經(jīng)缺損，然后將橫斷神經(jīng)的遠、近端分別加橡皮帽封閉。脛神經(jīng)損傷組中，又隨機分為四個實驗組:脛神經(jīng)切斷即刻，皮膚源性前體細胞直接注射組;肌肉萎縮產(chǎn)生后，培養(yǎng)液注射組;肌肉萎縮產(chǎn)生后，皮膚源性前體細胞注射組

9、;肌肉萎縮產(chǎn)生后，皮膚源性前體細胞體外誘導分化的神經(jīng)元樣細胞注射組。分別在細胞移植術后第4、8、12周，取標本，采用免疫熒光染色定性分析皮膚源性前體細胞以及皮膚源性前體細胞體外誘導分化的神經(jīng)元樣細胞在體內(nèi)表達神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF的情況。
　　結果:與皮膚源性前體細胞移植入損傷的周圍神經(jīng)中相比，將皮膚源性前體細胞移植入完整的未損傷的周圍神經(jīng)中，其存活率明顯降低。在損傷的周圍神經(jīng)環(huán)境中，急性損傷后較慢性損傷

10、后移植細胞存活率高。將皮膚源性前體細胞和皮膚源性前體細胞誘導分化的神經(jīng)元樣細胞分別移植入離斷脛神經(jīng)的遠端，術后不同時間點觀察，兩種細胞均能在體內(nèi)存活，且在各時間點后者細胞存活率較前者高。在術后第4、8、12周取材，兩種細胞在損傷的周圍神經(jīng)中的存活率隨時間推進均明顯下降。在細胞移植術后第12周時，皮膚源性前體細胞和其誘導分化的神經(jīng)元樣細胞在損傷的周圍神經(jīng)中均仍然存活，且在體內(nèi)亦均表達神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。

11、>　　結論:皮膚源性前體細胞在不同的周圍神經(jīng)環(huán)境中表現(xiàn)出不一樣的細胞存活率。皮膚源性前體細胞和其誘導分化的神經(jīng)元樣細胞在損傷的周圍神經(jīng)中至少可以存活12周。體外將皮膚源性前體細胞誘導分化成神經(jīng)元樣細胞可以提高移植術后細胞在損傷周圍神經(jīng)中的存活率。皮膚源性前體細胞和其誘導分化的神經(jīng)元樣細胞在體內(nèi)均可表達神經(jīng)營養(yǎng)因子。今后可在此基礎上研究皮膚源性前體細胞和其誘導分化的神經(jīng)元樣細胞對促進神經(jīng)再生、延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用。
　　第三部

12、分:皮膚源性前體細胞及其體外誘導分化成的神經(jīng)元樣細胞移植延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的實驗研究
　　目的:研究皮膚源性前體細胞和皮膚源性前體細胞誘導分化的神經(jīng)元樣細胞移植對失神經(jīng)骨骼肌萎縮的作用。
　　方法:將脛神經(jīng)損傷模型受體組每一只Lewis大鼠脛神經(jīng)在其進入腓腸肌以上1厘米處橫斷，并造成0.5厘米的神經(jīng)缺損，然后將橫斷神經(jīng)的遠、近端分別加橡皮。一周后，隨機將受體大鼠分為三組，分別注射培養(yǎng)液、皮膚源性前體細胞、皮膚源性前體細胞體

13、外誘導分化的神經(jīng)元樣細胞。在細胞移植術后第4、8、12周先對大鼠行步態(tài)分析，然后分別取腓腸肌和脛神經(jīng)測定腓腸肌張力、肌張力、肌肉橫截面積維持率、神經(jīng)內(nèi)軸突數(shù)量，有髓神經(jīng)纖維密度、G比值等，并對肌肉組織行Mallory三色染色分析其組織纖維化程度。
　　結果:皮膚源性前體細胞和皮膚源性前體細胞誘導分化的神經(jīng)元樣細胞移植后均能促進腓腸肌萎縮后下肢功能的恢復。皮膚源性前體細胞、皮膚源性前體細胞誘導分化的神經(jīng)元樣細胞和對照組相比均能延緩失