梅葉冬青對糖尿病創(chuàng)傷保護體內外活性初步研究.pdf

1、目的:
　　1觀察梅葉冬青提取物對HUVEC細胞增殖以及遷移作用。
　　2檢測梅葉冬青提取物抗高糖誘導的細胞凋亡作用。
　　3初步觀察梅葉冬青軟膏劑對大鼠糖尿病創(chuàng)面潰瘍愈合效果。
　　4通過病理切片HE染色以及膠原三色染色驗證梅葉冬青提取物對創(chuàng)面肉芽組織及膠原生成情況。
　　5通過免疫組化CD31，CD68和TGF-β1驗證梅葉冬青提取物對組織炎癥細胞浸潤及誘導新生血管生成的作用。
　　方法:

2、　　1給予HUVEC細胞梯度濃度的梅葉冬青提取物處理后，以MTT法測定各組HUVEC細胞增殖率，通過經(jīng)典細胞劃痕實驗檢測梅葉冬青對細胞遷移的作用。
　　2將HUVECs分別在生理濃度葡萄糖NG(5mmol/L)和高糖HG(30mmol/L)條件下培養(yǎng)后Hoechest33258染色后熒光染色法，定性觀察細胞核形態(tài)變化，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染結合流式細胞儀定量檢測抗高糖誘導凋亡。
　　3通過采用腹腔注射STZ（鏈

3、脲佐菌素）誘導SD雄性大鼠Ⅰ型糖尿病造模。將大鼠隨機分為正常組和糖尿病組。糖尿病組又隨機分為5％給藥組、10％給藥組、陰性對照組和莫匹羅星陽性對照組，通過比較造糖模組與正常組體重與血糖值的差別來驗證造模成功與否。后剪去大鼠背脊兩側直徑1.8cm的圓形全層皮膚造局部潰瘍模型。
　　4在糖尿病潰瘍模型的基礎上給予相應給藥處理，之后于第7天，第14天，第21天定期對創(chuàng)面進行拍照并比較各組潰瘍愈合率差異。
　　5在Ⅰ型糖尿病潰瘍造模

4、成功后各組相應給藥的基礎上，以CD31抗體特異性顯示血管內皮細胞觀察微血管陽性表達的改變，并通過對生物分子CD68，Masson膠原的陽性表達試圖解釋梅葉冬青對糖尿病潰瘍提高細胞增殖能力而形成肉芽組織，促進膠原蛋白重塑，誘導血管生成增殖分化的作用機制。
　　結果:
　　1在細胞活性檢測MTT實驗和細胞劃痕遷移實驗中，增殖率以及細胞遷移率結果顯示在25μg/mL-100μg/mL劑量范圍內梅葉冬青對HUVECs有增殖效應及促細

5、胞遷移作用，與細胞對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，且在劑量范圍內隨著藥物濃度增加，量效關系較為顯著。
　　2抗凋亡相關實驗中，Hoechest33258染色顯示梅葉冬青提取物可明顯抑制高糖誘導的細胞形態(tài)變化;亦可減少凋亡引發(fā)的細胞核碎裂;AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式細胞儀定量檢測陰性對照組細胞早期及中晚期細胞凋亡率顯著升高，而給予梯度濃度梅葉冬青提取物處理后凋亡率相應減少（P＜0.05）。
　　3梅葉冬青軟

6、膏高低劑量治療組的創(chuàng)面愈合明顯比空白對照組快(P＜0.05)，且高劑量組創(chuàng)面愈合較低劑量愈合更佳。
　　4病理切片HE染色及免疫組化染色的結果表明4個組中10％梅葉冬青軟膏給藥組在促進創(chuàng)面愈合，加快膠原合成，增加內皮細胞黏附分子(CD31)的陽性表達，上調轉化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白陽性表達上效果最好。
　　結論:
　　1梅葉冬青對體外人臍靜脈內皮細胞HUVEC的增殖、遷移及高糖誘導內皮細胞損傷具有保護作用，