低氧誘導因子-1對肝細胞生長因子基因表達調控機制的研究.pdf

1、目的： 第一部分：(1)觀察氯化鈷(CoCl2)及HIF-1α過表達對乳鼠心肌細胞及人宮頸癌Hela細胞存活及凋亡狀況的影響。(2)觀察CoCl2模擬的低氧以及由pcDNA3-HIF-1α真核表達質粒轉染介導的HIF-1α過表達對乳鼠心肌細胞和Hela細胞中HGF/c-Met系統(tǒng)mRNA和蛋白表達的調節(jié)。(3)對人HGF基因啟動子區(qū)進行生物信息學分析，尋找可能介導HGF低氧表達調控的轉錄因子作用位點。 第二部分：根據(jù)生物

2、信息學分析結果，在Hela和轉染效率較高HEK293細胞中，研究HIF-1α對TGF-β2基因表達調控的作用機制，并進一步觀察重組轉化生長因子-β2(TGF-β2)對Hela細胞中HGF表達的影響， 方法： 第一部分：(1)體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細胞和Hela細胞，應用MTT和流式細胞儀檢測CoCl2對乳鼠心肌細胞和Hela細胞存活、增殖及凋亡的影響。(2)構建pcDNA3-HIF-1α真核表達質粒(3)免疫印跡檢測CoC

3、l2和pcDNA3-HIF-1α質粒轉染誘導的HIF-1α過表達后，Hela細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達。(4)RT-PCR檢測100μmol/LCoCl2作用6～72h后，心肌細胞中HGFmRNA的表達。(5)WesternBlot檢測100μmol/LCoCl2作用心肌細胞12h后HIF-1α蛋白的表達。(6)相對熒光實時定量PCR檢測CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質粒轉染后，Hela細胞中HGF/c-Metm

4、RNA的表達。(7)ELISA檢測CoCl2對Hela細胞中分泌性HGF蛋白表達的影響。(8)利用生物信息學分析人HGF基因啟動子區(qū)可能的轉錄因子結合位點。 第二部分：(1)構建pGL3-EPO-HRE熒光素酶報告質粒和pGL3-TGF-β2及其五個突變體的熒光素酶報告質粒。(2)WesternBlot和雙熒光素酶報告基因法檢測CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質粒轉染后，Hela和HEK293細胞中HIF-1α蛋白的表達量

5、及其DNA結合活性。(3)相對熒光實時定量PCR檢測250μmol/LCoCl2單獨作用Hela和HEK293細胞6h后，TGF-β2mRNA的表達，以及CoCl2處理和pcDNA3-HIF-1α質-3-粒轉染后，Hela細胞中TGF-β2mRNA的表達。(4)雙熒光素酶報告基因檢測CoCl2和pcDNA3-HIF-1α質粒轉染對TGF-β2啟動子區(qū)報告基因及其相應突變載體報告基因活性的影響。(5)在HEK293細胞中進行CHIP實驗，

6、證實HIF-1α在TGF-β2基因啟動子區(qū)的結合位點。(6)ELISA法檢測重組TGF-β2作用Hela細胞后，HGF蛋白的表達量。 結論： (1)心肌細胞和Hela細胞對CoCl2毒性的耐受程度不同，心肌細胞較低而Hela細胞較高。 (2)HIF-1α過表達對Hela細胞的調亡作用可能是通過改變凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的比值來實現(xiàn)的。 (3)在心肌細胞和Hela細胞中，CoCl2和pcDNA3-H