RNAi沉默HSP70基因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的：熱休克蛋白70（heat shock protein70，HSP70）在多種腫瘤中高表達(dá)，在宮頸癌中HSP70基因也是高表達(dá)的，表明該基因在癌變過(guò)程中起著重要的作用。研究表明，腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，需要大量的HSPs作為“分子伴侶”來(lái)調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖的過(guò)程，HSPs參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷的修復(fù)，被認(rèn)為與細(xì)胞周期，腫瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤免疫以及機(jī)體對(duì)腫瘤治療耐受性的發(fā)生及腫瘤預(yù)后等密切相關(guān)。為進(jìn)一步了解HSP70基因在宮頸癌

2、發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，本文采用RNAi方法，制備針對(duì)HSP70基因的特異性siRNA序列，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，觀察HSP70基因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，闡明HSP70基因在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的作用，為治療宮頸癌提供新的基因治療靶點(diǎn)。
　　 方法：1.針對(duì)HSP70基因設(shè)計(jì)siRNA序列，克隆到空載體pTZU6+1中，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。2.在Lipofectamine

3、TM2000的介導(dǎo)下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞分為三組：第一組為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染重組體pHSP70-siRNA，第二組為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體pTZU6+1，第三組為空白對(duì)照組，即不加轉(zhuǎn)染試劑也不加任何質(zhì)粒。分別在轉(zhuǎn)染48h后，提取各組HeLa細(xì)胞總RNA和蛋白，采用RT-PCR、Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后HeLa細(xì)胞中HSP70基因的表達(dá)情況，以鑒定該重組體的表達(dá)。3.在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h，采用MTT方法

4、檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖的變化。在轉(zhuǎn)染48h收集各組細(xì)胞，采用AO/EB雙染色法檢測(cè)各組細(xì)胞形態(tài)的變化，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)重組體pHSP70-siRNA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期分布的影響。
　　 結(jié)果：1.pHSP70-siRNA經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，結(jié)果顯示重組體構(gòu)建成功，并將其命名為pHSP70-siRNA。2.將重組體pHSP70-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞后，采用RT-PCR、1％瓊脂糖凝膠電泳可獲

5、得HSP70和內(nèi)參GAPDH的2個(gè)條帶，實(shí)驗(yàn)組中HSP70/GAPDH灰度比值為（0.35±0.03），而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中HSP70/GAPDH的灰度比值分別為（0.76±0.05）、（0.66±0.07）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，實(shí)驗(yàn)組中HeLa細(xì)胞mRNA的表達(dá)相對(duì)量與陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果表明：重組體pHSP70-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌H

6、eLa細(xì)胞能特異性降低HSP70 mRNA在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。Western blot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的HSP70/β-actin灰度比值分別為（2.46±0.39）、（4.68±0.32）、（4.57±0.22）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：實(shí)驗(yàn)組HeLa細(xì)胞的蛋白表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)

7、染重組體pHSP70-siRNA后的宮頸癌HeLa細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。3.重組體pHSP70-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞，分別在24、48、72h，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算：抑制率（％）=[1-處理組OD（570）值/空白組OD（570）值]×100％，在24h，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的抑制率分別為10.35±0.42、4.11±0.16、3.58±0.31，在48h的抑制率分別為1

8、7.99±0.44、4.00±0.19、3.56±0.23，在72h的抑制率分別為15.97±0.61、3.97±0.16、3.63±0.33，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且實(shí)驗(yàn)組在48h時(shí)細(xì)胞抑制率達(dá)到最高，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組體pHSP70-siRNA對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖有明顯的抑制作用。AO/EB染色法結(jié)果

9、表明轉(zhuǎn)染重組體pHSP70-siRNA的宮頸癌HeLa細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期分布，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期分別占（51.76±0.80）％、（42.16±0.64）％、（6.09±0.16）％，陰性對(duì)照組細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期分別占（61.18±0.29）％、（36.76±0.21）％、（2.06±0.09）％，空白對(duì)照組細(xì)胞G0/G1、

10、S、G2/M期分別占（60.70±0.35）％、（37.44±0.65）％、（1.85±0.30）％，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組體pHSP70-siRNA后，G2/M和S期細(xì)胞有所增加，G0/G1期細(xì)胞減少，說(shuō)明重組體pHSP70-siRNA可能通過(guò)阻滯細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞堆積在S期和G2/M期，從而阻止HeLa細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制HeLa細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，得到實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的凋亡率分別為37.07±0.

11、75％、3.06±0.09％、3.04±0.07％，且從流式細(xì)胞圖上可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞有明顯的凋亡二倍體峰。
　　 結(jié)論：1.酶切鑒定和測(cè)序分析重組體證明pHSP70-siRNA構(gòu)建成功。2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組體pHSP70-siRNA入宮頸癌HeLa細(xì)胞，①HSP70基因的表達(dá)能有效抑制。②宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖受到抑制。③重組體pHSP70-siRNA使HeLa細(xì)胞堆積在S期和G2/M期，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，并出現(xiàn)凋亡二倍體峰