VPA聯(lián)合ATRA抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖的分子制研究.pdf

1、背景:
　　子宮頸癌占女性惡性腫瘤的第二位,僅次于乳腺癌,該病的發(fā)病呈年輕化和上升化趨勢。每年大約有500,000名婦女被診斷為侵襲性子宮頸癌,80％來自于發(fā)展中國家,而且有一半患者死于此病。手術(shù)治療目前已被認(rèn)為是早期子宮頸癌的首選方法,但是對于后期、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,手術(shù)治療的效果是很差的。另外,此期的患者通常對化學(xué)藥物治療是耐藥的,而且大多此期的患者本身的體質(zhì)很差,也很難耐受化療和放療,所以大多數(shù)患者都死于無法控制。因此,

2、尋找一種新的低副作用的治療子宮頸癌的方法是必要的。
　　組蛋白去乙?；敢种苿? Histone deacetylase inhibitor,HDACi)對人類多種腫瘤具有潛在的抗腫瘤治療作用,因為其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡作用。丙戊酸鈉(Valproic acid,VPA)作為一種抗精神病藥物而被用來治療癲癇和情緒失控,在此治療濃度范圍內(nèi)作為HDACi時僅產(chǎn)生輕微的副作用,甚至當(dāng)血清濃度超過正常治療范圍時也是

3、如此。據(jù)報道,在子宮頸癌中組蛋白去乙?；?Histone deacetylases,HDACs)是過表達(dá)的,而且從子宮頸細(xì)胞涂片中組蛋白H3的磷酸化和乙?；揭脖砻?組蛋白H3的修飾與子宮頸癌疾病進(jìn)程從宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CINⅠ)到CINⅡ再到CINⅢ之間有明顯的相關(guān)性。因此HDACs被認(rèn)為是治療子宮頸癌的一個靶點。
　　全反式維甲酸(All-trans

4、retinoic acid, ATRA)一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化得藥物,其同時具有調(diào)控正常上皮細(xì)胞分化。目前的臨床實驗已表明,ATRA在子宮頸癌和癌前病變中具有化療和誘導(dǎo)化療的作用。ATRA的作用通路是由RA受體介導(dǎo)的。在所有的RA受體中,RARβ(尤其RARβ2)被認(rèn)為起主要的腫瘤抑制作用,而且它的缺失和腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。RARβ2的低表達(dá)在多種腫瘤中可見,包括肺癌、乳腺癌、頭頸部癌和子宮頸癌。腫瘤細(xì)胞中此種受體的缺失和其基因啟動子區(qū)

5、組蛋白的超甲基化和去乙酰化有關(guān)。因此,HDAC抑制劑聯(lián)合ATRA可能會恢復(fù)沉默的RARβ2的表達(dá),進(jìn)而可在多種腫瘤中發(fā)揮ATRA的誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制及促凋亡作用。
　　目的:
　　研究VPA聯(lián)合ATRA對宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞株的生長抑制作用,并探討其分子機(jī)制,為子宮頸癌的治療提供理論依據(jù)和治療線索。
　　方法
　　1.體外實驗:
　　采用3mM VPA、1μM ATRA、1μg/mL順鉑(diammi

6、ne dichloroplatinum DDP)單獨和聯(lián)合作用于子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞,對照組僅加溶媒;
　　(1)采用MTT法檢測藥物處理后子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞生長抑制率
　　(2)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測藥物處理后子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞中Ki67的表達(dá)差異。
　　(3)采用Western-blot方法檢測藥物處理后子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞中AC-H3、RARβ2、p53、STAT3

7、、p-STAT3、p21及cyclinD1的表達(dá)差異。
　　(4)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測藥物處理后子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞的周期。
　　2.體內(nèi)實驗:
　　將生長狀態(tài)良好的HeLa及SiHa細(xì)胞接種到CD1 nu/nu裸鼠左側(cè)肩胛部皮下,每只裸鼠接種細(xì)胞5×106個,待成瘤后,分別給與VPA采取腹腔注射終濃度為(300mg/kg/d),ATRA(15mg/kg/d)采取灌胃方法DDP采取尾靜脈注射終濃度為(

8、2mg/kg),每周2次,對照組給予生理鹽水。治療時間為4周。
　　(1)每2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,按照公式:腫瘤體積=(長×寬2)/2計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。
　　(2)28d后處死動物,并將腫瘤組織剝離提取總蛋白,Western-blot方法檢測AC-H3、RARβ2、p53及p-STAT3及其下游基因的表達(dá)情況
　　(3)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測裸鼠瘤組織中Ki67的表達(dá)變化
　　結(jié)果:

9、>　　1.體外實驗:
　　(1)MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA聯(lián)合ATRA對細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA聯(lián)合ATRA可降低細(xì)胞中Ki67的表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)Western-blot結(jié)果顯示,VPA聯(lián)合ATRA顯著提高子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞中AC-H3、RARβ2、p53及p21表達(dá),降低STAT3、p-STAT3及

10、cyclinD1蛋白表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(4)FCM結(jié)果發(fā)現(xiàn),VPA聯(lián)合ATRA可使子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞周期阻滯于G1期,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.體內(nèi)實驗:
　　(1)VPA聯(lián)合ATRA顯著抑制裸鼠瘤生長,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DDP組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　(2)Western-blot結(jié)果顯示,VPA聯(lián)合AT

11、RA顯著提高裸鼠瘤組織中AC-H3、RARβ2、p53及p21表達(dá),降低STAT3、p-STAT3及cyclinD1蛋白表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPA聯(lián)合ATRA可降低裸鼠瘤組織中Ki67的表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　(VPA)聯(lián)合(ATRA)可抑制子宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯,AC-H3、RARβ2、p53表