Netrin-1基因表達對顱腦損傷后大鼠血腦屏障影響作用及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后病灶神經(jīng)組織出現(xiàn)不同程度的變性壞死,腦組織自身供血調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)變化,血腦屏障功能出現(xiàn)異常,自身通透性改變,并發(fā)生血管性與細胞毒性腦組織水腫,神經(jīng)組織細胞生化代謝紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)變化。而中樞神經(jīng)組織,血腦屏障及脈管系統(tǒng)修復都與神經(jīng)導向因子(neural guidance factor)有著密切的聯(lián)系,越來越多的研究跡象表明,顱腦損傷后血腦屏障的變化過程中有多種神經(jīng)導向因子參與?；谝陨涎芯?/p>

2、背景,本課題擬通過檢測大鼠顱腦損傷模型中 Netrin-1基因及腦微血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達的變化,觀察Netrin-1基因對腦微血管內(nèi)皮細胞緊密連接的影響,以求進一步了解Netrin-1基因對顱腦損傷后微血管的調(diào)節(jié)機制,希望為顱腦損傷的治療提供新的實驗基礎和理論依據(jù)。
　　方法:
　　采用改進型Feeney自由落體重型顱腦損傷大鼠模型模擬顱腦損傷。將90只成年SD(Sprague–Dawley)大鼠按隨機數(shù)字表法分為假

3、手術組、顱腦損傷(TBI組)和陰性對照組。Evans Blue法檢測顱腦損傷后腦組織中血腦屏障完整性的改變情況;采用免疫熒光法、RT-PCR、Western-Blot法檢測Netrin-1及TJ相關蛋白閉合蛋白-5(claudin-5)、咬合蛋白(occludin)和胞質(zhì)緊密粘連蛋白-1(ZO-1)在三組大鼠腦組織中的表達情況(傷后6h、24h、48h、72h、96h),并分析Netrin-1與claudin-5、occludin及ZO

4、-1之間的相關性;又將大鼠顱腦損傷后腦微血管內(nèi)皮細胞進行體外分離及培養(yǎng);構建含 Netrin-1全長基因的真核表達載體pZsGreen1-C1-Netrin-1;觀察Netrin-1基因過量表達對大鼠顱腦損傷后血腦屏障影響。具體如下:分三組進行實驗:空白對照組(PBS代替質(zhì)粒轉染組),陰性對照組(轉染空載體組)和實驗組(Netrin-1質(zhì)粒轉染組)。2、觀察轉染Netrin-1穩(wěn)定轉染后三組大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中TJ相關蛋白閉合蛋白-5

5、(claudin-5)、咬合蛋白(occludin)和胞質(zhì)緊密粘連蛋白-1(ZO-1)的表達水平變化。
　　結果:
　　1、建立了基于改進型Feeney自由落體腦損傷裝置的大鼠顱腦損傷的動物模型。隨著顱腦損傷發(fā)生時間的延長,腦組織中神經(jīng)元變性的程度也逐漸加重,間質(zhì)也可出現(xiàn)水腫、出血的改變。Evans Blue法檢測顱腦損傷后血腦屏障完整性的結果表明,手術組中腦實質(zhì)中 EB染料的含量隨著損傷時間的延長而逐漸增加,于72小時時相

6、時達到高峰,96小時時逐漸下降,與假手術組相比具有明顯的差異。而在顱腦損傷模型中,免疫熒光和蛋白電泳檢測均表明血管內(nèi)皮細胞中緊密連接(Tight Junction,TJ)相關蛋白(claudin-5、occludin及ZO-1)的表達明顯降低,而Netrin-1的表達呈逐步上升。
　　2、根據(jù)文獻報道的經(jīng)典方法,我們成功分離并體外培養(yǎng)了大鼠顱腦損傷模型中腦組織里的血管內(nèi)皮細胞。分離得到的血管內(nèi)皮細胞具有典型的內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)

7、,呈貼壁生長,細胞梭形或星形,有伸長的觸角,與周圍細胞相互吻合形成連接;構建的含有Netrin-1全長基因的表達載體pEGFP-C1經(jīng)過測序和酶切驗證,確定插入的序列準確無誤。
　　3、通過免疫熒光檢測,穩(wěn)定轉染了pEGFP-C1-Netrin-1表達載體的內(nèi)皮細胞中目的基因Netrin-1的表達顯著升高,表現(xiàn)為強陽性信號;蛋白電泳結果表明, Netrin-1的表達含量也明顯升高;免疫熒光、蛋白電泳和RT-PCR檢測結果發(fā)現(xiàn), N

8、etrin-1轉染組中內(nèi)皮細胞內(nèi)緊密連接相關蛋白(claudin-5、occludin及ZO-1)的表達量均隨著的Netrin-1含量的增加而顯著升高,兩者之間呈現(xiàn)正相關趨勢。
　　結論:
　　1、基于改進型Feeney自由落體腦損傷裝置,成功建立了大鼠顱腦損傷的動物模型,分離并體外培養(yǎng)了損傷模型中腦組織血管內(nèi)皮細胞,為后續(xù)進一步深入研究顱腦損傷時血腦屏障的改變情況奠定了良好的實驗基礎。
　　2、顱腦損傷發(fā)生后,腦組織