非小細胞肺癌預后相關評價標志物的篩選.pdf

1、背景:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在國內(nèi)和國際上已位居各種惡性腫瘤的首位。其中非小細胞肺癌占肺癌的80％。造成肺癌死亡率居高不下的最主要的原因是缺少準確的早期診斷及有效的治療效果監(jiān)測手段。由于肺癌早期沒有明顯癥狀,80%以上的肺癌患者到醫(yī)院就診時已屬晚期,失去了外科手術和多學科根治治療的最佳時機。加之肺癌的預后較差,總體5年生存率只有10-15%。即便是I期的非小細胞肺癌(Non Small Cell Lung Canc

2、er,NSCLC),手術治療后仍有約30%的患者死于腫瘤復發(fā)和(或)轉移。自身免疫抗體是機體免疫系統(tǒng)針對以基因結構和功能異常為實質的一系列病理變化所產(chǎn)生的免疫應答產(chǎn)物。作為一種新型的腫瘤標志物,自身免疫抗體在血液中表達水平的變化能夠直接或間接反映病理狀況的改變,也是導致具有相同組織病理類型和分期的腫瘤患者表現(xiàn)不同預后,或不同治療反應原因之一。本實驗擬將噬菌體展示技術與蛋白質芯片技術相結合,利用篩大量已存的NSCLC患者血清及隨訪結果選出

3、新型NSCLC高敏感性和特異性的血清自身免疫抗體作為分子標志物用于NSCLC的預后評價。
　　方法:1.提取5份非小細胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)術后腫瘤組織總RNA,純化mRNA并構建T7噬菌體cDNA文庫。2.利用NSCLC預后良好和不良患者血清對T7文庫進行生物淘洗,挑選出1268個腫瘤特異性的T7單克隆構建蛋白芯片。3.構建蛋白芯片,并分別用23分預后良好患者血清和34分預后不

4、良血清孵育芯片并進行 Cy5/Cy3雙熒光標記。4.分析掃描芯片所得數(shù)據(jù),篩選出能夠區(qū)分預后良好和不良血清的診斷標志物組合并進行留一法驗證其準確性。5.對腫瘤特異性的T7插入序列進行PCR測序,Blast所得DNA序列并進行分析。
　　結果:1.成功構建非小細胞T7噬菌體cDNA文庫,滴度檢測表明原始文庫滴度為3.7×106pfu/mL。隨機挑取96個噬菌斑進行PCR檢測,結果表明文庫的重組率為95%,符合質量要求。2.文庫經(jīng)擴增

5、,滴度檢測為7×1010 pfu/mL。隨機挑取96個噬菌斑進行PCR檢測,結果表明文庫重組率為95%,97.9%克隆(插入片段)大于250bp,10.5%克隆大于750bp。生物淘洗后隨機挑選96個克隆進行 PCR,結果表明淘洗后文庫重組率為98%,92.9%克隆大于250bp,18.4%克隆大于750bp。淘洗后重組率明顯提高,并且含有大片段的克隆得到明顯富集。3.構建的蛋白芯片經(jīng)Cy5、Cy3雙熒光檢測系統(tǒng)及統(tǒng)計學篩選分析芯片后,

6、得到最佳評價組合含6個NSCLC預后相關標志物,其聯(lián)合診斷準確率達到80.7%,敏感性為85.3%,特異性為73.9%,AUC為0.825。測序及Blast分析表明其中3個標志物是已知癌細胞轉移和預后相關分子,分別是 abl-interactor1(ABI1),pleiotrophin(PTN)和surfactant protein B(SFTPB)。另外3個標志物都是人基因組中未研究過的基因。
　　結論:成功構建非小細胞肺癌T7