高效非病毒基因載體的構(gòu)建及重組樹突狀細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤的免疫治療.pdf

1、目的:構(gòu)建篩選高效非病毒基因轉(zhuǎn)染載體,用于攜載報(bào)告基因及目的基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞(DendriticCell,DC).通過理化性質(zhì)和生物學(xué)手段評(píng)價(jià)非病毒轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染效率、安全性及轉(zhuǎn)染機(jī)制,并在小鼠模型上評(píng)價(jià)以基因轉(zhuǎn)染DC為疫苗預(yù)防黑色素瘤生成的效果。
　　 方法:1、合成和表征β-聚氨酯(Polyβ-aminoester,PBAE),殼聚糖-聚醚酰亞胺(Chitosan-Polyetherimide,CP)及精胺.右旋糖酐(Sp

2、ermine-Dextran,SD)三種非病毒基因轉(zhuǎn)染材料;2、孵育法制備非病毒基因轉(zhuǎn)染材料/DNA納米復(fù)合物,并對(duì)各種材料/DNA復(fù)合物進(jìn)行表征,通過攜載蟲熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)?；蚓G熒光蛋白EGFP質(zhì)粒等報(bào)告基因?qū)δ[瘤細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)染;3、進(jìn)一步利用上述制備的攜載有報(bào)告基因質(zhì)粒的材料/DNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染DC,利用流式細(xì)胞技術(shù)及熒光顯微成像技術(shù)考察納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率、利用MTT法考察復(fù)合物細(xì)胞毒性,利用共聚焦顯微成像技術(shù)考察復(fù)合物入核

3、入胞情況,從而篩選出適于DC轉(zhuǎn)染的安全高效載體;4、利用上述材料/DNA復(fù)合物包裹腫瘤相關(guān)抗原基因及細(xì)胞性趨化因子受體基因共轉(zhuǎn)染DC,考察該DC疫苗免疫預(yù)防抑制小鼠黑色素實(shí)體瘤效果;5、利用所篩選的載體材料攜載腫瘤相關(guān)抗原基因及細(xì)胞性趨化因子受體基因轉(zhuǎn)染DC,利用Transwell方法考察基因重組DC體外游走遷移情況,并通過細(xì)胞示蹤結(jié)合載體熒光成像技術(shù)考察經(jīng)轉(zhuǎn)染DC體內(nèi)游走遷移情況.
　　 結(jié)果:成功合成PBAE、CP與SD等非

4、病毒基因轉(zhuǎn)染材料.通過孵育法成功制備PBAE,CP和SD的基因復(fù)合納米粒。TEM觀察表明SD/DNA復(fù)合物是結(jié)構(gòu)均一類球形復(fù)合納米粒。通過攜載報(bào)告基因?qū)?xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染結(jié)果表明三種材料載體基因復(fù)合物對(duì)于腫瘤細(xì)胞株均有良好的轉(zhuǎn)染活性。熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明經(jīng)三種非病毒載體攜載的DNA均能成功進(jìn)入DC胞漿及細(xì)胞核。三種非病毒基因轉(zhuǎn)染材料攜載EGFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與市售試劑Lipofectamine2000(Lipo)

5、/DNA復(fù)合物相比,CP與SD的基因復(fù)合納米粒對(duì)DC具有較佳轉(zhuǎn)染效率及生物安全性,對(duì)于后者,其入胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SD/DNA在入胞抑制劑NaN3及MBCD存在下入胞量減少,證明其入胞途徑為能量依賴性的小窩-脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑.經(jīng)SD攜載趨化性細(xì)胞因子受體CCR7質(zhì)粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染的DC在體外遷移實(shí)驗(yàn)中較Lipo基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染DC顯示出更高的遷移活性;進(jìn)一步,在體內(nèi)遷移實(shí)驗(yàn)中亦顯示出更明顯的淋巴趨向歸巢現(xiàn)象。在exvivo實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)SD攜載

6、的黑色素瘤抗原gp100質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DC疫苗具有良好的免疫抑制黑色素實(shí)體瘤效果,而經(jīng)CP攜載的gp100抗原質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DC疫苗免疫抑瘤活性較差。進(jìn)一步的DC疫苗免疫實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)SD攜載抗原質(zhì)粒gp100和CCR7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DC疫苗組產(chǎn)生了顯著的抑瘤效果并提高荷瘤小鼠生存率。
　　 結(jié)論:成功合成PBAE,CP與SD三種非病毒基因轉(zhuǎn)染材料,其對(duì)腫瘤細(xì)胞株具有高效安全的轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)篩選SD攜載的DNA納米復(fù)合物,對(duì)于DC具有良好的轉(zhuǎn)染活