ESAT-6-Ag85A融合基因DNA疫苗增強(qiáng)卡介苗初免的免疫原性和保護(hù)性.pdf

1、背景與目的：
　　 使用BCG作為初免疫苗的異源性初免增強(qiáng)方案，可能將成為最有希望的新型TB免疫措施。ESAT-6和Ag85A是機(jī)體抗TB感染的兩個(gè)主要的保護(hù)性抗原。本研究中，我們克隆了ESAT-6和Ag85A的融合基因，分別構(gòu)建了表達(dá)ESAT-6和Ag85A融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pPro685A和真核表達(dá)質(zhì)粒pcD685A，研究了pcD685A增強(qiáng)BCG初免誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時(shí)探討pcD685A增強(qiáng)BCG初免對(duì)小鼠抗TB感染的

2、保護(hù)性。
　　 方法：
　　 1．利用PCR技術(shù)從M.tb H37Rv 株中擴(kuò)增Ag85A 編碼基因fbpA和ESAT-6 編碼基因esxA，利用基因拼接(GeneSOEing)方法，合成esxA-fbpA 融合基因,并分別克隆入原核表達(dá)載體pProEXHTb和真核表達(dá)載體PcDNA3.1(+)中，重組質(zhì)粒命名為pPro685A和pcD685A。
　　 2．將pPro685A 重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌

3、BL21，誘導(dǎo)并純化出r685A 蛋白。蛋白的表達(dá)和純化的過(guò)程，分別用SDS-PAGE 驗(yàn)證，并用anti-ESAT-6和anti-Ag85A Ab 經(jīng)Western blotting 驗(yàn)證。純化r685A 蛋白的純度進(jìn)一步用SDS-PAGE 證實(shí)，并經(jīng)BCA 法定量。
　　 3．將pcD685A 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli DH5α，規(guī)?；崛　⒓兓痯cD685A重組質(zhì)粒，并經(jīng)分光光度法測(cè)定質(zhì)粒濃度。
　　 4．

4、利用BCG（中國(guó)株）初免pcD685A 增強(qiáng)的方式免疫C57BL/6 小鼠。通過(guò)ELISA法檢測(cè)外周血抗r685A 蛋白IgG 抗體，qRT-PCR檢測(cè)肺臟表達(dá)的IFN-γ和IL-10的手段，來(lái)評(píng)價(jià)在小鼠模型中的免疫原性。
　　 5．對(duì)免疫后小鼠用M.tb H37Rv 毒株攻擊實(shí)驗(yàn)進(jìn)行攻擊，測(cè)定組織荷菌量、組織病理學(xué)改變等指標(biāo)評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)性。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功的構(gòu)建了esxA-fbpA融合基因的真核

5、表達(dá)載體和原核表達(dá)載體。
　　 2．SDS-PAGE和Western blotting證實(shí)r685A原核表達(dá)和純化成功。純化的r685A經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)。
　　 3．pcD685A誘導(dǎo)表達(dá)了特異性IgG的抗體反應(yīng)，BCG初免pcD685A增強(qiáng)免疫組明顯高于其它組。qRT-PCR檢測(cè)肺臟細(xì)胞因子，除了空載體組，其他各組的IFN-γ反應(yīng)水平均增加。pcD685A增強(qiáng)BCG初免組誘導(dǎo)小鼠肺臟產(chǎn)生了最高劑量的IFN-γ，并

6、比單獨(dú)BCG組或者pcD685A組IFN-γ有顯著提高。
　　 4．更重要的是pcD685A增強(qiáng)免疫BCG初免與單獨(dú)BCG或pcD685A組相比，能明顯的減少肺臟和脾臟的荷菌量。
　　 5．小鼠用M.tb H37Rv毒株攻擊后，肺臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示BCG初免pcD685A增強(qiáng)組的肺臟病理變化最輕微。
　　 結(jié)論：
　　 因此，我們的研究顯示pcD685A可能將是一種有效地增強(qiáng)BCG免疫的抗TB疫苗。