小鼠TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)胚胎發(fā)育早期平滑肌細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　血管發(fā)育在胚胎期器官發(fā)育、成熟以及成體后組織損傷修復(fù)中均起重要的作用。血管平滑肌增生是許多心血管疾病諸如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。成體血管中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）是特異性較高的細(xì)胞，其主要功能是收縮，參與調(diào)節(jié)血壓和維持組織器官的血流灌注。成體VSMC處于增殖和合成能力較低的分化表型；然而在某些病理?xiàng)l件如動(dòng)脈粥樣硬化和血

2、管成形術(shù)后，VSMC呈現(xiàn)高合成、高增殖的合成表型。VSMC由分化表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇褪悄承┬难芗膊“l(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，因此對(duì)VSMC分化的調(diào)控機(jī)制研究是臨床上防治增生性心血管病的前提。
　　研究細(xì)胞分化常用的模型是胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ES細(xì)胞)。ES細(xì)胞分離于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM),具有自我更新和多向分化潛能兩大顯著特性，是研究早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化、基因

3、表達(dá)調(diào)控等發(fā)育學(xué)事件的一個(gè)理想模型。胚胎小體（embryonic bodies,EB）是ES細(xì)胞在去白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor,LIF）培養(yǎng)下自發(fā)形成的細(xì)胞團(tuán)，它可以模擬體內(nèi)早期胚胎發(fā)育的全過(guò)程，是研究VSMC譜系分化成熟的理想體外模型。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因功能研究工具。本實(shí)驗(yàn)旨在利用RNA干擾技術(shù)建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1,

4、TGF-β1)shRNA真核表達(dá)載體，研究TGF-β1在胚胎發(fā)育早期對(duì)VSMC分化的影響。
　　TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育，尤其對(duì)心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用；然而其調(diào)控VSMC分化、遷移、增殖等過(guò)程的機(jī)理目前并不十分明確。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，通過(guò)建立EB二維分化模型觀察了SMα-actin陽(yáng)性細(xì)胞的分化特點(diǎn)，初步探討了TGF-β1對(duì)胚胎早期VSM

5、C分化的影響。
　　方法：
　　1.小鼠TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列，設(shè)計(jì)合成三對(duì)短鏈寡核苷酸，退火后形成雙鏈DNA并克隆至入門(mén)載體pEN_mH1c。將插入目的基因片段的入門(mén)載體與帶有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標(biāo)簽的shRNA真核表達(dá)載體pDS_hpEy進(jìn)行LR重組反應(yīng)，完成三個(gè)TGF-β1shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，分

6、別命名為pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc。并同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照載體命名為pDS_T0。
　　2.NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染用0.25％胰酶及0.53mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）室溫下消化融合的NIH/3T3細(xì)胞，傳代至3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50％～70％融合時(shí)，按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)用脂質(zhì)體將pDS_T0、pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至NIH/3T

7、3細(xì)胞，并在含有G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選，10d后得到穩(wěn)定表達(dá)上述載體的細(xì)胞克隆。
　　3.克隆的擴(kuò)增和鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pDS_T0、pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達(dá)載體的NIH/3T3細(xì)胞克隆擴(kuò)增后分別提取總RNA和總蛋白，用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)差異，鑒定表達(dá)載體沉默效率。同時(shí)利用BrdU摻入和流式細(xì)胞術(shù)觀察TGF-β1表達(dá)下調(diào)后對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖功能的影響，從功

8、能上鑒定上述載體的沉默效率。
　　4.小鼠ESCs的培養(yǎng)小鼠ESCs培養(yǎng)于經(jīng)絲裂霉素C（mitomycinC,MMC）10μg/mL處理2h的飼養(yǎng)層細(xì)胞STO（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株）上。當(dāng)ESCs生長(zhǎng)至亞融合時(shí)進(jìn)行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。
　　5.TGF-β1shRNAESCs株的建立將小鼠ESCs接種于0.1％明膠包被的六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約50％～70％融合時(shí)，按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)用脂質(zhì)

9、體將TGF-β1shRNA載體pDS_Tc和陰性對(duì)照載體pDS_T0轉(zhuǎn)染至ESCs，18h后細(xì)胞傳代至100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，以500mg/LG418進(jìn)行篩選，1w后在熒光顯微鏡下挑取GFP陽(yáng)性單克隆并傳代。
　　6.EBs二維模型的建立ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25％胰酶及0.53mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）消化后，接種到明膠包被的培養(yǎng)皿中實(shí)施選擇性

10、篩選，3h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無(wú)白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）外與ESCs培養(yǎng)液相同。懸浮培養(yǎng)5d后，將EBs接種于0.1％明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，制備二維模型；
　　7.免疫細(xì)胞化學(xué)染色固定的EBs經(jīng)0.05mol/LTBS洗滌后，在含0.25％TritonX-100和0.5mol/LNH4Cl的TBS中通透20min。

11、5％山羊血清室溫封閉1h后，與一抗在4°C孵育過(guò)夜。一抗為SMα-actin。不加一抗做陰性對(duì)照片。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC）或異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標(biāo)記抗體。
　　8.RT-PCR參照Trizol說(shuō)明書(shū)，提取不同時(shí)間點(diǎn)EBs中的RNA。取RNA1μg進(jìn)行SMα-actin、myocar

12、din及GAPDH的半定量PCR。
　　9.蛋白質(zhì)印跡分析參照常規(guī)方法，提取不同時(shí)間點(diǎn)ESCs及EBs中的總蛋白，然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。一抗分別為SMα-actin、myocardin和β-actin抗體。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)目的蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1shRNA的NIH/3T3細(xì)胞篩選以濃度為500mg/L的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)TGF-β1shRNA的

13、NIH/3T3細(xì)胞。在熒光顯微鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)GFP。
　　2.TGF-β1shRNA表達(dá)載體對(duì)NIH/3T3細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達(dá)載體的細(xì)胞其TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組pDS_T0呈現(xiàn)不同程度下調(diào)，以pDS_Tc組最明顯。
　　3.TGF-β1表達(dá)下調(diào)對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖功能的影響以BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢

14、測(cè)干擾載體對(duì)細(xì)胞增殖能力的抑制作用，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc的細(xì)胞BrdU染色陽(yáng)性率均較pDS_T0組明顯減少，以pDS_Tc組減少最為顯著，提示后者具有較強(qiáng)基因沉默效率。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）分析細(xì)胞周期，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc的細(xì)胞均較對(duì)照組pDS_T0出現(xiàn)明顯G1期阻滯，其中以pDS_Tc組G1期阻滯最為明顯。
　　4.穩(wěn)定表達(dá)T

15、GF-β1shRNA的ESCs篩選及鑒定于熒光顯微鏡下挑取表達(dá)GFP的pDS_Tc和pDS_T0陽(yáng)性ESCs克隆并傳代擴(kuò)增。以WesternBlot檢測(cè)上述兩種ESCs克隆及其在分化成EBs后TGF-β1的表達(dá)變化，結(jié)果顯示pDS_Tc陽(yáng)性ESCs克隆及EBs的TGF-β1蛋白表達(dá)較pDS_T0對(duì)照組明顯降低。
　　5.EBs各發(fā)育階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)EBs經(jīng)懸浮培養(yǎng)后迅速分化，1d～2d后可形成典型的簡(jiǎn)單EBs（simple embr

16、yoid bodies,SEBs），隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，SEBs進(jìn)一步分化形成成熟囊性EBs（cystic embryoid bodies,CEBs），CEBs具有類(lèi)似早期胚胎的原始內(nèi)胚層、基底膜、柱狀原始外胚層及囊腔等結(jié)構(gòu)。
　　6.TGF-β1表達(dá)下調(diào)對(duì)EBs二維分化模型形態(tài)學(xué)的影響懸浮培養(yǎng)5d的EBs接種于明膠包被的24孔板中，EBs貼壁后第2d對(duì)SMα-actin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞即平滑肌樣細(xì)胞分布特點(diǎn)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染

17、pDS_T0載體的對(duì)照組EBs貼壁分化后，90％以上SMα-actin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)散在分布于EBs延伸細(xì)胞的周邊。轉(zhuǎn)染pDS_Tc載體的EBs分化早期SMα-actin免疫熒光染色陽(yáng)性的細(xì)胞成群出現(xiàn)在EBs邊緣細(xì)胞密集處，且分化細(xì)胞向周邊延伸速度較慢。
　　7.TGF-β1表達(dá)下調(diào)對(duì)EBs分化不同時(shí)期VSMC分化標(biāo)志物表達(dá)的影響對(duì)兩組EBs實(shí)施RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)SMα-actin和m

18、yocardin兩組分化標(biāo)志物在表達(dá)初期和表達(dá)高峰期的差異，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pDS_Tc載體的EBs在發(fā)育過(guò)程中SMα-actin和myocardin的表達(dá)均低于轉(zhuǎn)染pDS_T0載體的陰性對(duì)照組，提示TGF-β1可明顯影響VSMC的分化。
　　結(jié)論：
　　1.帶有GFP標(biāo)簽的TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體能夠阻斷ESCs及EBsTGF-β1基因表達(dá)，可作為研究TGF-β1調(diào)控血管發(fā)育機(jī)制的一個(gè)工具；
　　2.TGF-β

19、1表達(dá)下調(diào)可抑制EBs二維分化模型中平滑肌樣細(xì)胞的分化，且SMα-actin染色陽(yáng)性細(xì)胞主要密集分布在EBs周?chē)只?xì)胞群邊緣，細(xì)胞向周邊延伸速度減慢；
　　3.ESCs及其形成的EBsTGF-β1表達(dá)降低后，VSMC分化標(biāo)志物表達(dá)明顯降低，提示TGF-β1可以促進(jìn)胚胎發(fā)育早期VSMC的分化。
　　4.利用RNAi技術(shù)構(gòu)建特定基因表達(dá)下調(diào)的ESCs及EBs模型可以作為一種理想的替代基因敲除的分子生物學(xué)工具用于基因功能學(xué)的研究