白藜蘆醇通過(guò)TLR4-NF-κB信號(hào)通路對(duì)肥胖者骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞抗炎功能的評(píng)價(jià).pdf

1、肥胖是一種慢性代謝性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，目前全球超重及肥胖的成年人達(dá)15億。骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種退行性關(guān)節(jié)病變，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙。有研究表明，體重指數(shù)(Bodymass index，BMI)在27以上每增加1，將會(huì)增加15％的患OA概率。而目前肥胖在全球范圍內(nèi)的急劇增加已經(jīng)成為OA增加的重要原因之一。
　　肥胖參與OA的發(fā)生主要涉及生物力學(xué)機(jī)制、脂肪因子和炎癥

2、因子，但上述機(jī)制均未被完全闡明。其中，由肥胖導(dǎo)致的全身慢性低度炎癥在OA發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。肥胖時(shí)游離脂肪酸增多，激活巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞表面的TLR4，從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)炎性信號(hào)通路，促使炎癥因子白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）和TNF-α等的釋放，造成局部和全身慢性炎癥。Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)是一種模式識(shí)別受體，其主要生物學(xué)功能是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究

3、發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中也有TLR4表達(dá)，并且TLR4的激活可引起IL-1β增加、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖減少。因此，通過(guò)抑制OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的TLR4表達(dá)，進(jìn)而降低相關(guān)炎癥因子的合成，有可能改善OA癥狀，維持關(guān)節(jié)功能。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種植物多酚類(lèi)物質(zhì)，在葡萄皮、漿果和堅(jiān)果中含量很多。一些研究顯示，RES可以通過(guò)抑制凋亡、抗炎和抗氧化作用發(fā)揮抗OA效應(yīng)。其中，RES發(fā)揮抗炎作用的中心環(huán)節(jié)是通過(guò)抑制NF

4、-κB的活化，進(jìn)而下調(diào)促炎癥因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。在一項(xiàng)對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，RES能抑制TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)。然而，目前仍不清楚在人炎性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，RES是否可通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)來(lái)抑制NF-κB的活化。
　　因此，本研究選擇肥胖OA患者的膝、髖關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，首先觀察RES對(duì)退變的人炎性軟骨細(xì)胞的作用;然后通過(guò)檢測(cè)TLR4、NF-κB、IL-1β基因表達(dá)，探討其是否可通過(guò)抑制TLR4/N

5、F-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗OA的作用。本研究為進(jìn)一步闡明OA的發(fā)病機(jī)制及探索OA的營(yíng)養(yǎng)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究目的：
　　探討RES是否可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗OA的作用，為進(jìn)一步闡明OA的發(fā)病機(jī)制及探索OA的營(yíng)養(yǎng)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　取因OA而行膝、髖關(guān)節(jié)置換的肥胖者關(guān)節(jié)軟骨，采用兩步酶消化法分離培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至第3代使用。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色及蛋

6、白多糖甲苯胺藍(lán)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。應(yīng)用MTT法測(cè)定RES(0～100μmol/L)對(duì)加/不加IL-1β處理的軟骨細(xì)胞增殖活力的影響。然后采用RES（0～100μmol/L）處理預(yù)先經(jīng)過(guò)IL-1β孵育的軟骨細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TNF-α的水平。RT-PCR法檢測(cè)TLR4、NF-κB、IL-1β mRNA表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　5ml的軟骨組織經(jīng)兩步酶消化后可獲得

7、106～107的軟骨細(xì)胞。原代軟骨細(xì)胞24小時(shí)后貼壁，細(xì)胞呈三角形或多角形，2周左右細(xì)胞融合成層。傳代后，細(xì)胞貼壁時(shí)間較原代細(xì)胞短，增殖速度快，約7～8天鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶瓶底，細(xì)胞形態(tài)與原代沒(méi)有明顯差異。
　　2、軟骨細(xì)胞表型鑒定
　　Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，軟骨細(xì)胞胞漿均呈棕黃色;蛋白多糖甲苯胺藍(lán)染色顯示，軟骨細(xì)胞呈藍(lán)紫色，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周?chē)兴{(lán)紫色異染顆粒。
　　3、不同濃度RES對(duì)細(xì)胞活性影響
　　DMSO溶

8、劑組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（P＞0.05）;與DMSO溶劑組相比，6.25和12.5μmol/L RES組，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P＜0.05);加IL-1β誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞活力降低（P＜0.05）;而6.25和12.5μmol/L RES可顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低(P＜0.05)。
　　4、不同濃度RES對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肥胖者OA軟骨細(xì)胞分泌TNF-α水平的影響
　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，培養(yǎng)基上清

9、中TNF-α水平明顯增加(P＜0.01);相比IL-1β誘導(dǎo)組，不同濃度RES（6.25～100μmol/L）處理后，TNF-α水平均顯著降低(P＜0.01)。
　　5、不同濃度RES對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肥胖者OA軟骨細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的影響
　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01);相比IL-1β誘導(dǎo)組，不同濃度RES（6.25～100μmol/L）處理后，TLR4 mRNA表

10、達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。
　　6、不同濃度RES對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肥胖者OA軟骨細(xì)胞NF-κBmRNA表達(dá)的影響
　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，NF-κB mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01），相比IL-1β誘導(dǎo)組，不同濃度RES(6.25～100μmol/L)處理后，NF-κB mRNA表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。
　　7、不同濃度RES對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的肥胖者OA軟骨細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響

11、　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，IL-1β mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）;相比IL-1β誘導(dǎo)組，不同濃度RES（6.25～100μmol/L）處理后，IL-1β mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、RES在6.25～100μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的肥胖者OA軟骨細(xì)胞活力無(wú)抑制作用;其中6.25與12.5μmol/LRES可增強(qiáng)細(xì)胞活力。
　　2、6.25～100μmol/L的RES對(duì)