E2F1調控PBK表達上調導致前列腺癌不良預后.pdf

1、研究背景和目的:前列腺癌（PCa）是一種常見的男性泌尿系統(tǒng)腫瘤，盡管在我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率都相對于歐美國家仍然處于相對低的水平，但隨著我國人民生活水平的提高、壽命的延長、飲食結構的改變以及醫(yī)療提高，前列腺癌的發(fā)病率在我國逐年上升，發(fā)病率在男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中上升至第三位。早期前列腺癌患者在一定時期內行去勢治療(ADT)對腫瘤有明顯的抑制作用，可在成功接受手術治療并配合相應的輔助治療后夠獲得良好的治療效果，但是相當部分前列腺

2、癌患者在治療一段時間后，前列腺癌逐漸對內分泌治療產(chǎn)生抵抗，轉變?yōu)槿莸挚骨傲邢侔?CRPC），這部分病人多死于腫瘤的遠處轉移?，F(xiàn)階段，如何有效地降低前列腺癌的侵襲能力和防治前列腺癌的遠處轉移已經(jīng)成為攻克前列腺癌的一個重要難題。另一方面，前列腺癌的自然病史和預后都呈現(xiàn)出多樣性，既可終身無任何癥狀，亦可表現(xiàn)出高度的侵襲性，即使行根治性手術后也可很快地發(fā)生轉移并引起可怕的疼痛，最終導致死亡?；颊叩淖罴阎委煼桨感枰R床醫(yī)生對早期患者前列腺腫瘤的

3、潛在侵襲性及預后進行客觀評估，以指導患者個體化治療，同時避免過度治療及大量醫(yī)療資源浪費。目前，前列腺癌的篩查及診斷主要依靠直腸前列腺指檢、影像學、血清學和病理穿刺。但它們均不能很好的作為前列腺癌簽證侵襲性和預后進行客觀評估。PSA是目前較為公認的前列腺癌指標，對前列腺癌的診斷敏感性比較高，特別是晚期患者（86％~100%）。但血清PSA水平受很多因素影響，前列腺增生、急性前列腺炎及直腸指檢等均可能導致血清PSA升高。當它處于4～10 n

4、g/毫升時，是前列腺癌的診斷灰區(qū)，難以區(qū)分前列腺癌及前列腺增生癥，將更難以判定腫瘤的預后。而進行病理穿刺檢查時，也會受取材的部位以及病理醫(yī)生主觀判斷的影響，且由于腫瘤的異質性，僅通過形態(tài)學檢查很難評斷腫瘤的生物學行為，因而難以對前列腺癌的惡性程度進行客觀、準確的判定。
　　基于前列腺癌的特點及目前診療水平，深入研究探討前列腺癌侵襲力的分子生物學機制，尋找和發(fā)現(xiàn)能夠準確地預測前列腺癌進展、復發(fā)和轉移的新型分子標記物將會使我們進一步地

5、了解前列腺癌發(fā)展過程中的潛在機制，為前列腺癌患者提供更有效的靶向治療，達到更好的治療效果。
　　在既往課題中，用基因芯片技術對中國人群前列腺癌與對照良性前列腺組織進行檢測中發(fā)現(xiàn)，總共有1444個基因（差異倍數(shù)≥1.5；P≤0.05）為差異表達基因。其中，有769個上調基因（53%）和675個下調基因（47%）。在芯片結果中發(fā)現(xiàn)PBK基因在前列腺癌表達明顯升高，達到16.33倍（p=0.043），在上調表達基因中排第7位。所以，預測

6、PBK的高表達可能是引起前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移等危險因素。并且利用多種預測及檢測手段發(fā)現(xiàn)，PBK受轉錄因子E2F1調控。
　　PDZ連接激酶/T-LAK細胞源蛋白激酶(PBK/TOPK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的新成員，由322個氨基酸組成，是一種新近發(fā)現(xiàn)的絲-蘇氨酸激酶。在正常組織中，Gaudet et al在成人睪丸、胎盤、心肌和胰腺組織中檢測到了PBK的mRNA，其中胎盤含量最豐富;并在骨骼肌、腎臟、肝臟和肺中

7、檢測到PBK的低水平表達。它在許多腫瘤中表達上調并導致疾病的不良預后，如淋巴瘤、白血病、乳腺癌、黑色素瘤和結腸癌等。Nandi等人應用阿霉素阻遏白血病細胞生長之后，PBK的表達明顯下降，表明PBK表達可能調控白血病細胞的生長或存活。相類似地，Park等人發(fā)現(xiàn)，運用siRNA抑制PBK的表達可顯著抑制細胞生長，敲除內源性PBK可抑制乳腺癌細胞生長，導致胞質分裂異常，最終腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
　　E2F1作為轉錄因子可調控許多下游基因，

8、有報道稱，在淋巴瘤中PBK的表達受細胞周期轉錄因子E2F1調控。E2F轉錄因子家族對于細胞的分化、增值和凋亡具有重要的調節(jié)作用。E2F家族蛋白的活性依賴于視網(wǎng)膜瘤抑制因子（retinoblastoma tumor suppressor）的相互作用，激活后能夠引起下游生長因子的信號傳導，從而調節(jié)與細胞周期相關的基因表達。E2F1是該轉錄因子家族中最具代表性的一員，可以通過P53依賴或非依賴通路激活ARF、TP73、APAF-1、和BH3

9、only BCL2家族蛋白，誘導細胞的凋亡。以往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中的DNA損傷或者促細胞分裂信號傳導能夠誘導E2F1表達的上調從而促進細胞的凋亡過程，由E2F1誘導的細胞凋亡被認為是一種對抗腫瘤細胞增殖的保護機制。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)高分期的腫瘤細胞中，RB能夠協(xié)同相關的致癌因子抑制E2F1所誘導的細胞凋亡，或者被EGFR/Ras/Raf信號通路阻斷其抑癌活性；體外細胞實驗證明阻斷E2F1在轉移黑色素瘤中的表達，明顯抑制了腫瘤細胞

10、的遷徙、侵襲和轉移能力。E2F1在不同的人類腫瘤細胞中都出現(xiàn)不同程度的異常表達，其中E2F1的表達水平上升與高分期的腫瘤轉移存在著重要聯(lián)系，并且與腫瘤患者的不良預后密切相關，E2F1可能與增強腫瘤侵襲力的相關基因啟動子上的位點結合，上調相關基因表達水平，預示著E2F1具有增強惡性腫瘤侵襲力的作用。另外也有研究團隊發(fā)現(xiàn) E2F1對于腫瘤的局部浸潤侵襲和形成遠處轉移同樣存在重要的影響力。由此可見，E2F1作為人類腫瘤中一個重要的轉錄因子，具

11、有“陰陽”兩面的作用，既可以依賴自身的功能誘導細胞的凋亡，阻礙腫瘤細胞的增殖分化；又能夠與相關促癌基因的轉錄位點結合，調節(jié)基因的轉錄水平，從而增強腫瘤細胞的侵襲力；這種有趣的雙重作用提示其致癌作用與基因外調控機制或者組織特異性相關。Sharma的研究證實雄激素受體（androgen receptor）無論在前列腺癌細胞株還是在腫瘤種植動物中，都受到E2F1的轉錄調控，RB的缺失是E2F1結合AR轉錄位點的前提；他們深入分析非雄性激素依賴

12、前列腺癌的轉移機制，同樣發(fā)現(xiàn)E2F1和AR表達的增加對腫瘤的進展有重要的意義。
　　在前期動物實驗中，發(fā)現(xiàn)抑制E2F1表達后可降低動物模型中腫瘤的侵襲力，表明轉錄因子E2F1可能通過某個/某些下游基因而調控腫瘤生長。經(jīng)查閱文獻后發(fā)現(xiàn)E2F1可調控PBK導致腫瘤惡性程度變化。在我們之前的研究中，利用高通量芯片檢測也發(fā)現(xiàn)PBK在前列腺癌中明顯上調表達，與良性前列腺表達差異倍數(shù)達16.33倍。因此，推測E2F1可能調控PBK導致腫瘤侵襲

13、力變化，并推斷此通路與前列腺癌的發(fā)生及不良預后相關。據(jù)了解，在前列腺癌中PBK是否受E2F1調控，及PBK的表達情況是否能預示前列腺癌的不良預后都仍未有報道。
　　材料：臨床病例，本研究經(jīng)過廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有病例均已簽署患者知情同意書，標本均嚴格遵守倫理及法律要求進行處理。
　　用于QRT-PCR研究的臨床病例，包括3例PCA及配對的3例癌旁組織，組織由廣州市第一人民醫(yī)院提供。用于West

14、ern blot研究的臨床病例，4對前列腺癌及癌旁冰凍組織由廣州市第一人民醫(yī)院標本庫提供。用于免疫組化研究的組織芯片購買于上海芯超生物技術有限公司。每張芯片均包括98例PCA及81例對照癌旁組織，所有病例均接受了根治性前列腺癌切除術治療，并且未在術前曾經(jīng)接受抗雄激素治療或者放射性治療。所有標本都經(jīng)過H-E染色并由病理科?？漆t(yī)生明確診斷。病理科醫(yī)生根據(jù)現(xiàn)行的國際前列腺癌病理分級評分標準（International Society of U

15、rological Pathology）對全部98例標本進行Gleason評分。每例標本均記錄以下相關臨床數(shù)據(jù)：年齡，術前PSA水平，Gleason評分。為了驗證E2F1和PBK在mRNA水平上的表達關系，利用了Tayl數(shù)據(jù)庫進行相關性分析，Taylor數(shù)據(jù)庫是一個包含149例PCA組織及對應癌旁組織的大樣本基因芯片庫，并且有詳細的病例臨床資料。Taylor數(shù)據(jù)庫中所有149個前列腺癌病例都做了為期1~175個月的術后隨訪（中位數(shù)為51

16、個月），以手術日為起點，以生化復發(fā)或死亡為隨訪的終點。若有病例死于其它疾病將被排除隨訪。
　　方法：首先利用QRT-PCR及Western blot技術分別檢測了3對及4對前列腺癌及對應癌旁標本中PBK的表達差異；接著利用大樣本免疫組化芯片檢測E2F1和PBK在前列腺癌和癌旁組織中的表達差異及兩基因之間的表達相關性。179例石蠟組織標本按照5微米的厚度進行病理切片，使用二甲苯溶液進行脫蠟，重新水化后的組織芯片行H-E染色或者免疫組

17、化。經(jīng)過蛋白水解消化和過氧化酶封閉組織玻片等步驟后，加入濃度為1:200/1:50（E2F1/PBK）的一抗在4C環(huán)境中過夜孵育。經(jīng)過洗滌和二抗孵育后，在顯微鏡下觀察染色情況。確認染色程度滿意，使用蘇木紫溶液復染，封片。正常前列腺組織用作為陰性對照。每塊組織玻片分別由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生獨立觀察，所有關于臨床病理和治療效果的患者資料均對觀察者隱瞞。最后的觀察結果由兩位醫(yī)生進行比對后確定，任何存在分歧的部分均重新觀察和討論后得出一致的

18、結果。CHIP-PCR技術進一步驗證E2F1與PBK的調控關系；為了從細胞層面進一步檢測及驗證E2F1和PBK在前列腺癌中的作用，用病毒瞬轉技術構建了siPBK、siE2F1及HI-E2F1前列腺癌細胞株，經(jīng)Western blot驗證構建成功的細胞株進行細胞的功能實驗，包括細胞遷移能力、細胞侵襲力及細胞增殖能力的檢測。最后利用Taylor數(shù)據(jù)庫對E2F1與PBK進行相關統(tǒng)計分析，包括在前列腺癌中的表達改變、兩者之間的表達相關性以及預后

19、相關分析。
　　統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理。所有的連續(xù)變量均表示為X?s。所有四格表資料均使用Fisher精確檢驗，非四格表記數(shù)資料使用Pearson卡方檢驗。在單因素和多因素分析中，Cox比例危險模型用于計算PBK的表達與無PSA生化復發(fā)生存率、無腫瘤遠處轉移生存率和總體生存率之間的關系。Kaplan–Meier法主要用于生存曲線分析并經(jīng)過log-rank檢驗。E2F1及PBK表達情況與各種臨床數(shù)據(jù)之間的

20、關聯(lián)使用兩獨立樣本t檢驗和χ2檢驗方法驗證。P<0.05代表具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：抑制E2F1表達降低了Lncap細胞在裸鼠內的侵襲力：前期實驗中，為了觀察E2F1在活體中與前列腺癌之間相互作用的影響，構建了E2F1表達下調的LNCaP前列腺癌細胞株及其對照組分別對4只裸鼠進行皮下注射。以每只小鼠脊柱為界分為左右兩邊，在左背部皮下接種sh-E2F1細胞，再在右邊皮下接種對照組細胞，并在約7周后處死實驗動物和取出腫瘤。用動物腫

21、瘤組織進行了體積統(tǒng)計及免疫組化實驗，結果顯示兩組間體積未見明顯差異，但在抑制E2F1后，腫瘤侵襲力下降，即vimentin表達減少，E-cadherin表達增加?？梢奅2F1在動物模型中對腫瘤體積未見明顯影響，但可以影響腫瘤的侵襲力。
　　運用了免疫組化技術對98例前列腺癌及81例良性前列腺組織進行染色，檢驗E2F1在前列腺癌中表達是否改變。結果發(fā)現(xiàn)E2F1主要在細胞核中表達，在PCa中表達比良性組織表達升高（PCa=4.15±1

22、.23 VS Benign=3.85±1.72，P=0.001），且在Gleason評分≥8與病理分期≥T3A的病例中，E2F1的IRS評分也比對應的分組評分高，分別是（GS≥8=5.11±0.83，n=70 VS GS<8=4.29±1.18，n=28；P=0.001）（≥T3A期=5.11±0.83，n=70 VS

23、mRNA芯片數(shù)據(jù)庫做E2F1與PBK表達相關性分析，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)它們表達相關。與E2F1一樣，對PBK進行了大樣本臨床組織芯片的免疫組化檢測，評分后進行E2F1與PBK相關性統(tǒng)計分析，分析結果與Taylor數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結果高度一致（r=0.492，p<0.001）。再進一步，我們還構建了抑制PBK、E2F1和過表達E2F1的Lncap及DU145細胞株，分別記為siPBK、si E2F1和HI-E2F1細胞株。構建細胞株后，做了QPCR驗證是

24、否構建有效以做后續(xù)功能實驗，結果顯示轉染siPBK的細胞株，PBK表達量明顯下降（Lncap：抑制率=94.79%，P=0.002；DU145：抑制率=84.78%，P=0.002）；轉染siE2F1的細胞株，E2F1表達量亦明顯下降（Lncap：抑制率=79.89%，P=0.006；DU145：抑制率=77.30%，P=0.002）；轉染了HI-E2F1的細胞株，E2F1表達量明顯升高（Lncap：Fold change=14424，

25、P<0.001；DU145：Fold change=8680.73，P<0.001）。細胞構建成功后，做了Western blot檢測，以了解PBK是否隨E2F1表達變化。結果表明，在DU145和Lncap細胞株中PBK均隨E2F1變化而變化，而抑制PBK的細胞株中，E2F1并沒有明顯改變。最后，利用CHIP-PCR做轉錄調控分析發(fā)現(xiàn)Lncap細胞株中實驗組比陰性對照組表達升高（Fold change=2.71）。以上結果均證明PBK在

26、mRNA和蛋白層面表達均與E2F1表達相關，且受E2F1轉錄調控。
　　PBK的mRNA與蛋白在前列腺癌組織中表達升高且與惡性程度相關：在以前研究中，將前列腺癌樣本和癌旁組織作為對照組，通過高通量mRNA基因芯片技術，檢測前列腺癌細胞中mRNA的表達情況。mRNA芯片結果表明，PBK是上調比較顯著的mRNA分子（Fold change=16.33，P<0.05，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，ac

27、cession number GSE28204）。為了驗證基因芯片的結果是否可靠，重新收取3對PCa及良性組織樣本做QPCR檢測，結果顯示與芯片一致，在腫瘤中PBK高表達。為了驗證PBK是否在蛋白水平也表達升高，利用了4例前列腺癌及4例良性前列腺組織行Western blot檢測，結果前列腺癌組織中PBK表達蛋白明顯升高。
　　另外，采用了免疫組化技術對98例前列腺癌及81例良性前列腺組織進行染色，以了解PBK在PCa及良性前列腺

28、組織中表達差異及表達部位。結果發(fā)現(xiàn)PBK主要在細胞膜及細胞核中表達，且在PCa中表達明顯高于良性前列腺組織。進一步，在Gleason評分≥8與病理分期≥T3A的病例中，PBK的IRS評分也比對應的分組評分高，分別是（GS≥8=5.25±0.80，n=70 VS GS<8=4.34±1.47，n=28；P=0.001）（≥T3A期=5.25±0.80，n=70 VS

29、PCa中高表達，且表達越高，PCa病理分化越差、臨床分期更偏向晚期。
　　E2F1和PBK高表達可增加前列腺癌細胞株的侵襲性、遷移及增殖能力：已成功構建的細胞株（前面已敘述），詳細做了細胞功能實驗，了解E2F1和PBK對細胞功能的影響。Transwell實驗每個細胞株我們都觀察了12小時和24小時，可以清楚地看到，siPBK和siE2F1細胞株的侵襲性均比對照組弱，而HI-E2F1細胞株的侵襲性比對照組強，Lncap及DU45細胞

30、株均如此。Wound healing實驗中，觀察了細胞6h、24h和48h細胞遷移情況。在DU145細胞株中，siPBK細胞株在24h及48小時中遷移能力較對照組弱，si E2F1及HI-E2F1未見明顯差異。而在Lncap細胞株中，siPBK及si E2F1細胞株在24h及48h的遷移能力均較對照組弱，HI-E2F1與它們相反。增殖實驗可以發(fā)現(xiàn)結果與Transwell相似，在Lncap及DU45細胞株的siPBK和si E2F1細胞株

31、的增殖能力均比對照組弱，而HI-E2F1細胞株的增殖能力比對照組強。
　　PBK表達與PCa臨床特征的關系：PBK表達與PCA臨床病例特征之間的關系詳見表格3。在我們的數(shù)據(jù)中，PBK高表達組前列腺癌組織與老年(P=0.022)、高Gleason評分(P=0.003)及高臨床病理分期相關。Taylor數(shù)據(jù)庫中的統(tǒng)計數(shù)據(jù)結果與我們相似，PBK高表達與老年(P=0.044)、高Gleason評分(P=0.009)、高臨床病理分期(P=0

32、.019)、臨床轉移(P<0.001)、總體生存率(P=0.008)及PSA生化復發(fā)(P=0.004)相關。
　　PBK高表達與PCa的生發(fā)復發(fā)相關：為了了解PBK與臨床預后相關性，運用Kaplan-Meier分析PBK與無生化復發(fā)率及總體生存率之間的關系，以Taylor數(shù)據(jù)庫中PBK表達的中位數(shù)將所有前列腺癌病例分成高表達組（n=71）和低表達組（n=69）。發(fā)現(xiàn)PBK表達與前列腺癌患者的總體生存率無顯著相關。而我們進一步發(fā)現(xiàn)，

33、它與無生化復發(fā)生存率顯著相關。
　　由此，進一步確定PBK是否為預測前列腺癌患者無生化復發(fā)生存率的獨立預后因素，采用用Cox回歸模型（cox regression）進行單因素綜合分析。在PBK原位雜交的隊列中，單因素分析表明，PBK表達越低，Gleason score越高，病理分期越高，則總體生化復發(fā)的風險越大。
　　結論：
　　1. E2F1與PBK都在PCa中表達升高；
　　2. E2F1與PBK在前列腺癌中