β-1，3-1，4-葡聚糖酶重組畢赤酵母的構(gòu)建及其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)作為一種重要的工業(yè)用酶，被廣泛應(yīng)用于釀酒和飼料工業(yè)中。目前國(guó)內(nèi)對(duì)葡聚糖酶的研究還處于初級(jí)階段，天然菌株產(chǎn)酶量及酶性能滿(mǎn)足不了實(shí)際應(yīng)用。隨著基因工程方法的應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)目的蛋白的工程菌表達(dá)提供的了可能?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究集中在構(gòu)建工程菌株來(lái)提高酶的產(chǎn)量和性能方面。本研究的主要目的即通過(guò)基因工程及分子生物學(xué)方法來(lái)提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶表達(dá)量，研究其酶學(xué)特性

2、，為生產(chǎn)中的問(wèn)題提供有效的解決途徑。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： ⑴采用PCR法從載體pLF3中擴(kuò)增出雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，并在基因兩端引入酶切位點(diǎn)EcoR I/Not I，插入帶有AOX啟動(dòng)子和α-信號(hào)肽的表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建出重組載體pPIC9K-bgl；經(jīng)Sac I線性化重組載體后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入Pichia pastoris GS115，使基因整合到酵母染色體上；最終篩選出甲醇利用型Hi

3、s+Mut+，其最高抗遺傳霉素濃度為2 mg mL-1約有7-8個(gè)拷貝數(shù)的重組GS115/pPIC9K-bgl。甲醇誘導(dǎo)重組菌表達(dá)β-1，3-1，4-葡聚糖酶，對(duì)誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件為pH6.0，最適溫度30℃，表達(dá)時(shí)間84 h。 ⑵利用3L發(fā)酵罐進(jìn)行重組畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化。先以甘油為碳源，在甘油補(bǔ)加階段，細(xì)胞干重達(dá)47.5 g L-1；甲醇誘導(dǎo)階段，流加甲醇控制溶氧維持在35％，誘導(dǎo)84 h后酶活達(dá)到最高值1

4、15.3 U mL-1，蛋白表達(dá)量131.8 mg L-1，細(xì)胞干重88.5 g L-1。并通過(guò)SDS-PAGE對(duì)重組蛋白進(jìn)行分析，得出分子量約為34 kDa，由于糖基化作用，比理論分子量大了約8 kDa，目的蛋白占胞外總蛋白約75％。 ⑶確定了β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。該酶在pH4.5-7.0之間相對(duì)穩(wěn)定，在pH6.0時(shí)酶活力達(dá)到最高，而在pH3.5-8.0間保溫60 min，酶活仍然有80％以上；最適反應(yīng)溫度5