SEDT-PA致病基因WISP3突變體在軟骨細胞中的表達及功能研究.pdf

1、第一部分晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進行性骨關節(jié)病(SEDT-PlA)致病基因WISP3突變體的構建 目的：Wnt誘導分泌蛋白3(WISP3)是晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進行性骨關節(jié)病(SED-PA)的致病基因，構建WISP3基因致病型(1000T-C，840delT)的突變體，為研究突變基因的表達、定位和功能及SEDT-PA的發(fā)病機制奠定基礎。 方法：用RT-PCR方法從正常人軟骨細胞獲得野生型WISP3基因的全長cDNA(

2、WT-WISP3)，用定點突變方法獲得已報道的兩種WISP3基因突變類型的全長cDNA(MUT<'1000T/C>和MUT<'840delT>)；經(jīng)T載體克隆，測序證實后，將它們再分別亞克隆至真核表達載體pcDNA3.1(+)和帶綠色熒光蛋白靶標的真核表達載體pEGFP-C2中，酶切和測序?qū)Σ迦肫芜M行分析和鑒定。 結果：構建的野生型WISP3基因和突變體的全長eDNA序列分別與文獻及SEDT-PA患者WISP3基因突變類型一致

3、；測序和酶切鑒定證實所有的插入片段序列正確。 結論：運用基因重組技術成功構建了SEDT-PA致病基因WISP3突變體，為進一步探討SEDT-PA的發(fā)病機制創(chuàng)造條件。 第二部分WISP3基因突變體在軟骨細胞中的表達、定位及其功能的研究 第一章WISP3基因突變體在軟骨細胞中的表達和定位 目的:比較觀察野生型和突變型WISP3蛋白在人軟骨細胞株C20/A4中表達和定位的差別。 方法:以空白載體pEGF

4、P-C2為對照,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將帶綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒WT-WISP3/pEGFP-C2、MUT<'1000T/C>/pEGFP-C2和MUT<'840delT>/pEGFP-C2瞬時轉(zhuǎn)染人軟骨細胞株C20/A4,48h后用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察上述質(zhì)粒的表達和定位。 結果:LSCM觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染空白載體pEGFP-C2的C20/A4細胞中熒光均勻分布于整個細胞,轉(zhuǎn)染攜帶野生型WISP3基因質(zhì)粒WT-WISP3/pE

5、GFP-C2的C20/A4細胞中熒光均勻分布于細胞漿和細胞膜,轉(zhuǎn)染攜帶突變WISP3基因質(zhì)粒MUT<'1000T/C>/pEGFP-C2和MUT<'840delT>/pEGFP-C2的C20/A4細胞中熒光在細胞漿中呈斑點狀染色和聚集現(xiàn)象。 結論:野生型WISP3蛋白定位于細胞漿和細胞膜。突變的WISP3基因?qū)е缕涞鞍自诩毎麧{內(nèi)異常濃聚可能是SEDT-PA發(fā)病的細胞生物學基礎之一。 第二章WISP3基因突變體在軟骨細胞中

6、表達和功能的研究 目的：將構建的WISP3基因突變體穩(wěn)定表達于人軟骨細胞株C20／A4中，觀察WISP3基因突變后在軟骨細胞中的功能變化。 方法：以空白載體pcDNA3.1(+)為對照，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒wT-WISP3／pcDNA3.1(+)、MUT<'1000T/C)／pcDNA3.1(+) 和MUT<'840delT>／pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人軟骨細胞株C20／A4，分別對轉(zhuǎn)染突變體的C20／

7、A4細胞、正常人和SEDT-PA患者的關節(jié)軟骨細胞進行細胞增殖和細胞周期測定，用吖啶橙／溴化乙啶活細胞染色(AO／EB)和流式細胞儀觀察細胞凋亡率的變化。半定量RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后的各組C20／A4細胞I、II型膠原(Collagen typeI，Collagen type II)，SOX9，纖維結合素(Fibronectin)和MMP-1等基因mRNA表達的變化。用Westem-blot檢測轉(zhuǎn)染后的各組C20／A4細胞WISP3和I

8、I型膠原蛋白的表達。 結果：半定量RT-PCR和Western blot顯示，各重組質(zhì)粒在人軟骨細胞株C20／A4中均呈高效表達；轉(zhuǎn)染突變體的C20／A4細胞表現(xiàn)為增殖速度加快，增殖指數(shù)增高、DNA合成增多和凋亡減少，上述改變與SEDT-PA患者的軟骨細胞改變一致；轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WISP3／pcDNA3.1(+)的C20／A4細胞能明顯增加Collagen type II的表達，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒MUT<'1000T/C>/pcD