結(jié)核分枝桿菌的耐藥性及結(jié)核病的宿主易感性研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)是一種細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌，生長(zhǎng)緩慢，1882年德國(guó)細(xì)菌學(xué)家郭霍(Koch)證實(shí)結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌，該菌能侵犯全身各器官，以肺為最常見(jiàn)。據(jù)WHO估計(jì)，全球每年約有800～1000萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例，至少有200-300萬(wàn)人死于結(jié)核病，由于艾滋病、吸毒、酗酒、貧困、免疫抑制劑的使用、人口流動(dòng)、結(jié)核分枝桿菌耐藥株出現(xiàn)等原因，20世紀(jì)末21世紀(jì)初，結(jié)核的發(fā)病率又有上升趨勢(shì)，并隨著有限的抗結(jié)核藥物

2、使用年數(shù)的增長(zhǎng)，結(jié)核菌的耐藥情況日漸嚴(yán)重，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)更為結(jié)核病的控制帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。我國(guó)的結(jié)核病疫情始終較為嚴(yán)重，是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，也是27個(gè)耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病(MDR/XDR-TB)高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。
　　結(jié)核發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果，目前全球雖有近1/3的人群感染結(jié)核分枝桿菌，但僅1/10人口發(fā)病。以往研究認(rèn)為結(jié)核的發(fā)病原因主要在于細(xì)菌因素、環(huán)境因素

3、和社會(huì)因素，但越來(lái)越多研究表明宿主也是重要因素，目前認(rèn)為結(jié)核的發(fā)病是宿主、病原體、環(huán)境綜合作用的結(jié)果。已有較多研究表明，結(jié)核易感性的遺傳因素在疾病中起重要作用，導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)結(jié)核易感性的差異，Khor等人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的SRC同源2結(jié)構(gòu)域蛋白(Cytokine-inducible SRChomology2(SH2) domain protein，CISH)基因的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核等多種感染性疾病的易感性有關(guān)，在不同疾病及不同人群中

4、基因的多態(tài)性位點(diǎn)及多態(tài)性頻率都不同。CISH是細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(SOCS)家族蛋白的一員，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過(guò)與STAT5競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞因子受體上的結(jié)合位點(diǎn)主要影響IL-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。鑒于IL-2在結(jié)核免疫中的關(guān)鍵作用，推測(cè)CISH有可能在結(jié)核病發(fā)病中起了重要作用
　　本研究收集上海市肺科醫(yī)院1432株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行體外藥敏測(cè)定，對(duì)上海地區(qū)的結(jié)核病耐藥情況進(jìn)行了分析。并采用病例-對(duì)照研究，收集511例初治肺結(jié)核患者及

5、500例健康對(duì)照者的資料，分析人群的營(yíng)養(yǎng)狀況指標(biāo)和社會(huì)環(huán)境影響因素與肺結(jié)核發(fā)病之間的關(guān)系。通過(guò)對(duì)898例結(jié)核病患者血液樣本采用SNaPshot技術(shù)進(jìn)行CISH基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分型，與825例健康者對(duì)照，了解上海地區(qū)漢族人群CISH基因多態(tài)性與結(jié)核易感性的關(guān)系，研究CISH基因多態(tài)性在結(jié)核發(fā)病中的作用。
　　第一部分上海地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥現(xiàn)狀研究
　　我國(guó)作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病亦在不

6、斷增多。我們對(duì)收集自上海市肺科醫(yī)院的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行了耐藥性分析，并比較初治與復(fù)治患者結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥率。上海市肺科醫(yī)院為上海市結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院，收治幾乎所有的上海市結(jié)核病患者。
　　2009年1月至2010年12月收集了上海市肺科醫(yī)院住院結(jié)核病患者中分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌菌株1432株，每例患者保留1株菌種。1432個(gè)患者的中位年齡為47(12～94)歲，其中男性1001例，女性431例;初治者837例，復(fù)治者5

7、95例。結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏測(cè)定方法:①取患者痰液或其他體液、組織標(biāo)本，經(jīng)前處理后放入BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)，②培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性后進(jìn)行涂片、染色、鏡檢確定抗酸分枝桿菌并接種至含PNB培養(yǎng)基及TCH培養(yǎng)基的培養(yǎng)管行菌種鑒定，③BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星的藥敏試驗(yàn)。
　　藥敏結(jié)果顯示:①1432株結(jié)核

8、分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥率（對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上抗結(jié)核藥物耐藥）為63.5％，對(duì)異煙肼的耐藥率最高，為46.4％，對(duì)鏈霉素、利福平和氧氟沙星的耐藥率均超過(guò)30％，對(duì)阿米卡星的耐藥率最低，為16.1％。②復(fù)治患者分離的結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥率明顯高于初治患者分離的菌株，初治患者菌株對(duì)7種抗菌藥的耐藥率均低于30％，復(fù)治者對(duì)阿米卡星和卷曲霉素的耐藥率分別為24.2％和29.2％，對(duì)其他抗結(jié)核藥的耐藥率均近50％或以上。③所有菌株對(duì)一線

9、抗結(jié)核藥物的耐藥率為53.1％，初治者耐藥率為33.8％，復(fù)治者為80.2％;④所有菌株對(duì)二線抗結(jié)核藥物的耐藥率為45.8％，初治者耐藥率為33.1％，復(fù)治者為63.7％，在二線結(jié)核藥物中氧氟沙星的耐藥率最高，為36.2％，阿米卡星的耐藥率最低，為16.1％。⑤所有菌株中MDR菌株占32.2％，XDR菌株占11.3％;在初治患者中MDR菌株占10.5％，復(fù)治患者占62.7％，兩者有顯著差異（P＜0.01）;在初治和復(fù)治患者中XDR株的檢

10、出率分別為3.8％和21.8％，兩者有顯著差異（P＜0.01）。⑥在所有MDR菌株中，XDR菌株占35.1％，初治者M(jìn)DR菌株中XDR株占36.4％，復(fù)治者M(jìn)DR菌株中XDR株占34.9％，初復(fù)治患者XDR/MDR比例無(wú)顯著差異（P=0.79）。⑦在所有MDR菌株中，pre-XDR菌株占42.3％，這些菌株90.3％對(duì)氧氟沙星耐藥。
　　結(jié)論:上海地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥性較高，除對(duì)阿米卡星的耐藥率在20％以下外，對(duì)多數(shù)

11、抗結(jié)核藥的耐藥率超過(guò)30％。53.1％的結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線抗結(jié)核藥物耐藥，其中對(duì)異煙肼的耐藥率最高。45.8％的結(jié)核分枝桿菌對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥，其中對(duì)氧氟沙星的耐藥率最高。所有菌株中，MDR菌株占32.2％，XDR菌株占11.3％。
　　第二部分初治肺結(jié)核患者易感因素分析
　　影響結(jié)核病發(fā)病的因素很多，包括貧窮、精神壓力、營(yíng)養(yǎng)不良、病毒感染，以及自身免疫力的變化等，各因素之間交互作用，該部分研究分析人群的營(yíng)養(yǎng)狀況指標(biāo)和社會(huì)

12、環(huán)境影響因素與肺結(jié)核發(fā)病之間的關(guān)系，為采取針對(duì)性的措施控制肺結(jié)核疫情提供依據(jù)。
　　我們收集2009.1～2011.1上海市肺科醫(yī)院的511例確診初治肺結(jié)核住院患者的病史資料，其中男性329例，女性182例，中位年齡34(12～79)歲，并收集同期入選的500例健康體檢者資料作對(duì)照。收集研究對(duì)象的信息包括:①社會(huì)環(huán)境影響因素資料:年齡、性別、婚姻、職業(yè)、教育背景、結(jié)核接觸史、粉塵接觸史、吸煙史、飲酒史等，②營(yíng)養(yǎng)狀況指標(biāo):身高、體重

13、、血總蛋白、白蛋白、甘油三酯、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行X2檢驗(yàn)、單因素分析、多因素Logistic回歸分析，確定初治肺結(jié)核患者的易感因素。
　　結(jié)果顯示，社會(huì)環(huán)境因素中，婚姻狀況(P=0.001)、職業(yè)(P＜0.001)、文化程度(P＜0.001)、吸煙史(P＜0.001)在病例組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。營(yíng)養(yǎng)狀況指標(biāo)中，體重指數(shù)(BMI)(P＜0.001)、血清總蛋白(P＜0.001)、白蛋白(P＜0

14、.001)、總膽固醇(P＜0.001)、甘油三酯(P＜0.001)、高密度脂蛋白、(P＜0.001)在病例組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，多因素Logistic回歸分析顯示:BMI(P＜0.001)、吸煙史(P＜0.001)、甘油三酯(P＜0.001)、高密度脂蛋白(P＜0.001)、低密度脂蛋白(P=0.003)與肺結(jié)核發(fā)病有顯著性相關(guān)性。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果顯示，文化程度低、離異或喪偶、吸煙是肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素。BM

15、I過(guò)低、營(yíng)養(yǎng)不良是結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素，與國(guó)外報(bào)道相仿。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，高含量的低密度脂蛋白是肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素，但血清高含量的甘油三酯和高密度脂蛋白似乎與肺結(jié)核發(fā)病負(fù)相關(guān)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　第三部分 CISH基因的單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核易感性的關(guān)系
　　已有較多研究表明，多種宿主基因多態(tài)性與結(jié)核易感性相關(guān)。2010年，Khor等發(fā)現(xiàn)CISH基因多態(tài)性與結(jié)核等多種感染性疾病易感性相關(guān)，且不同人群間多態(tài)性不同，與結(jié)核易

16、感性的關(guān)系也不同，近2年尚未見(jiàn)后續(xù)有關(guān)該基因與結(jié)核易感性相關(guān)的研究報(bào)道。本研究目的為了解中國(guó)漢族人群CISH基因SNP與結(jié)核易感性的關(guān)系。
　　我們選取上海市肺科醫(yī)院自2009.1-2011.1收治的898例確診結(jié)核病的患者，采用多重SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè)其血液標(biāo)本CISH基因5個(gè)SNP位點(diǎn)(rs148685070(-639), rs414171(-292), rs6768300(-163), rs2239751(+

17、1320),rs622502(+3415))的多態(tài)性，并與825例健康者對(duì)照。采用在線的SHEsis軟件結(jié)合SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)病例組和對(duì)照組SNPs檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括對(duì)照組基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn);等位基因頻率及基因型頻率在兩組間的比較;CISH基因SNPs與結(jié)核相關(guān)性的單因素及多因素logistic回歸分析;不同位點(diǎn)間連鎖不平衡分析;并在不同SNPs間構(gòu)建單倍型，估算其頻率，分析單倍型與結(jié)核易感性

18、的相關(guān)性。
　　結(jié)果顯示:①所測(cè)CISH基因5個(gè)SNPs位點(diǎn)中rs148685070只有一種等位基因C及一種基因型CC，無(wú)基因多態(tài)性，余4個(gè)位點(diǎn)均有基因多態(tài)性。②位點(diǎn)rs414171在結(jié)核病組中等位基因A的頻率(61.6％)高于對(duì)照組(57.6％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)，基因型A/A的頻率(38.8％)高于對(duì)照組(31.9％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011);位點(diǎn)rs2239751在結(jié)核病組中等位基因A的頻率(6

19、7.9％)高于對(duì)照組(64.5％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)，但基因型頻率在兩組中無(wú)顯著差異。③SNPs與結(jié)核易感性單因素分析結(jié)果顯示年齡、rs414171TA基因型、rs2239751CC基因型與結(jié)核易感性相關(guān)（P值分別為0.017，0.003，0.026，OR值分別為1.007，0.731，0.712）。④SNPs與結(jié)核易感性多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡始終是結(jié)核發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，隨著年齡的增加，結(jié)核病發(fā)

20、病的風(fēng)險(xiǎn)增加(P=0.017，OR=1.008)。在4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，rs2239751CC基因型及rs414171TA基因型是獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P值分別為0.011，0.002，OR值分別為0.671，0.710)。⑤連鎖不平衡分析結(jié)果顯示rs414171與rs2239751兩個(gè)位點(diǎn)間、rs6768300和rs622502兩個(gè)位點(diǎn)間存在連鎖不平衡。⑥單倍型分析顯示，共有3種單倍型頻率＞5％，在病例組和對(duì)照組中無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論: