重組人白細胞介素10對腫瘤壞死因子α誘導大鼠血管平滑肌細胞和NIH-3T3細胞syndecan-4蛋白表達的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致心血管疾病的重要原因之一。日益增多的證據(jù)表明，AS是一種對血管損傷的過度炎癥反應。血管損傷后，單核細胞、血小板和淋巴細胞粘附到血管壁，釋放一系列細胞因子和肽類生長因子，與特異性受體結合后轉導影響血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）和血管外膜成纖維細胞（advealtitial fibroblasts，AF）表型和生長的信號，因此促

2、進了晚期纖維增殖病變的發(fā)生。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）是炎癥反應的關鍵調節(jié)因子之一，可從多種不同的炎癥細胞中釋放，在AS發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是近年來研究最為廣泛的一種由體內產生的內源性的抗炎因子，在多種炎性疾病中發(fā)揮效應，其主要功能是限制和終止炎癥反應。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素（heparan sulfa

3、te，HS）類的跨膜轉運蛋白多糖syndecans家族的成員之一。Syndecan-4是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一，它作為一種與生長因子結合的共受體（co-receptor），調控著多種細胞生物學效應，在細胞伸展、識別、粘附、遷移和增殖控制中扮演著重要的角色，同時也介導炎癥反應。因此有必要研究syndecan-4在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的一系列潛在功能角色及相關干預，從而為動脈粥樣硬化的防治提供新的思路。 目的:

4、 以重組人白細胞介素10（recombinant human Interleukin10，rhIL-10）為研究對象，通過體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs和NIH/3T3細胞，應用MTS/PMS非放射性技術檢測rhIL-10對TNF-α誘導的大鼠胸主動脈VSMCs和NIH/3T3細胞增殖的作用，采用Western blotting蛋白免疫印跡分析方法觀察rhIL-10對TNF-α僅誘導的大鼠胸主動脈VSMCs和NIH/3T3細胞

5、syndecan-4蛋白表達的影響，進一步從細胞和分子水平上闡述syndecan-4蛋白在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法: 1.細胞增殖的檢測： 實驗一：應用96孔板體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs，用終濃度為20ng/mL TNF-α、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10聯(lián)用2

6、0ng/mL TNF-α分別作用24小時。每組濃度設6個副孔，同樣實驗條件重復6次，每組共36例實驗數(shù)據(jù)，并設立對照組進行比較，以明確應用各藥物刺激后的細胞是否比無刺激的細胞有變化。采用MTS/PMS法確定大鼠胸主動脈VSMCs的增殖狀態(tài)。 實驗二：應用96孔板體外培養(yǎng)NIH/3T3細胞，用終濃度為20ng/mL TNF-α、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10聯(lián)用

7、20ng/mL TNF-α、200nG/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時。每組濃度設7個副孔，同樣實驗條件重復3次，每組共21例實驗數(shù)據(jù)，并設立對照組進行比較，以明確應用各藥物刺激后的細胞是否比無刺激的細胞有變化。采用MTS/PMS法確定NIH/3T3細胞的增殖狀態(tài)。 2.Syndecan-4蛋白表達的檢測： 實驗一：體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，用終濃度為20ng/mL TNF-α、

8、100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時，裂解細胞提取蛋白，考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度，利用Western blotting蛋白免疫印跡法測定大鼠胸主動脈平滑肌細胞syndecan-4蛋白的表達情況。每組濃度重復實驗3次，共3例實驗數(shù)據(jù)，并設立對照組進行比

9、較。 實驗二：體外培養(yǎng)NIH/3T3細胞，用終濃度為20ng/mL TNF-α、100ng/mLrhIL-10、200ng/mL rhIL-10、100ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF一α、200ng/mLrhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α分別作用24小時，裂解細胞提取蛋白，考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度，利用Western blotting蛋白免疫印跡法測定NIH/3T3細胞syndec

10、an-4蛋白的表達情況。每組濃度重復實驗3次，共3例實驗數(shù)據(jù)，并設立對照組進行比較。 結果: 1、rhIL-10對TNF-α誘導的SD大鼠VSMCs增殖的影響; 在藥物刺激24小時的條件下，各組細胞的增殖率分別為：對照組1.822±0.455，TNF-α20ng/mL組2.130±0.270，rhIL-10100ng/mL組1.989±0.309，rhIL-10200ng/mL組2.010±0.370，TNF-α

11、20ng/mL聯(lián)用rhIL-10100ng/mL組1.918±0.322，TNF-α20ng/mL聯(lián)用rhIL-10200ng/mL組1.924±0.145。統(tǒng)計分析顯示：與對照組比較，20ng/mL TNF-α組能顯著刺激大鼠VSMCs的增殖（F=12.208，t=-3.494，P=-0.001），而100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10組單獨應用對大鼠VSMCs的增殖均無顯著影響（F=2.636，P>0.

12、05）。100ng/mLrhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α組與20ng/mL TNF-α組比較對VSMCs增殖均有顯著的抑制作用（F=7.964，P<0.05），但未存在劑量依賴性。 2、rhIL-10對TNF-α誘導的SD大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表達的影響; 以目的蛋白對照組灰度值與內參對照組灰度值的比值為1，其余各組syndec

13、an-4蛋白相對表達量分別為：TNF-α20ng/mL組1.287±0.070，rhIL-10100ng/mL組1.027±0.075，rhIL-10200ng/mL組1.017±0.067，TNF-α20ng/mL聯(lián)用rhIL-10100ng/mL組0.937±0.119，TNF-α20ng/mL聯(lián)用rhIL-10200ng/mL組0.833±0.051。統(tǒng)計分析表明，與對照組比較，20ng/mL TNF-α組能顯著刺激VSMCs的s

14、yndecan-4蛋白表達（F=49.971，t=-7.069，P=0.002），而rhIL-10100ng/mL、200ng/mL組單獨應用對VSMCs的syndecan-4蛋白表達均無顯著作用（F=0.162，P>0.05）。100ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α組與20ng/mL TNF-α組比較對VSMCs的syndecan-4蛋白表達均有顯

15、著抑制作用（F=23.304，P<0.01），但未存在劑量依賴性。 3、rhIL-10對TNF-α誘導的NIH/3T3細胞增殖的影響; 在藥物刺激24小時的條件下，各組細胞的增殖率分別為：對照組0.577±0.052，TNF-α20ng/mL組0.634±0.040，rhIL-10100ng/mL組0.587±0.035，rhIL-10200ng/mL組0.575±0.052，TNF-α20ng/mL聯(lián)用rhIL-101

16、00ng/mL組0.571±0.061，TNF-α20ng/mL聯(lián)用rhIL-10200ng/mL組0.575±0.068。統(tǒng)計分析顯示：與對照組比較，20ng/mL TNF-α組能顯著刺激NIH/3T3細胞的增殖（F=15.872，t=-3.984，P<0.001），而100ng/mL rhIL-10、200ng/mL rhIL-10組單獨應用對NIH/3T3細胞的增殖均無顯著影響（F=0.410，P>0.05）。100ng/mLrh

17、IL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α、200ng/mL rhIL-10聯(lián)用20ng/mL TNF-α組與20ng/mL TNF-α組比較對NIH/3T3細胞增殖均有顯著的抑制作用（F=7.893，P<0.01），但未存在劑量依賴性。 結論: 本研究證明了一定劑量的rhIL-10可顯著抑制TNF-α誘導的大鼠VSMCs和NIH/3T3細胞的增殖和syndecan-4蛋白的表達。因此，有必要進一步研究syndecan-4