MiR-375靶向轉錄調(diào)控因子Sp1在宮頸癌進展中的作用及其機制研究.pdf

1、宮頸癌是全球女性最常見的婦科惡性腫瘤之一。高危人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HR-HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的必要因素，已經(jīng)在99.7％的宮頸癌組織中證實HPVDNA的存在，其中HPV16、18是最為常見的高危類型。研究表明，HR-HPV表達的病毒癌基因E6和E7，可分別結合降解宿主細胞P53和Rb，并通過一系列分子事件，引起細胞周期、增殖、侵襲、轉移等生物學行為改變，促進細胞的惡性轉化，最終導致宮頸癌發(fā)生與進展。

2、
　　 miRNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子單鏈RNA，通過與靶基因mRNA(messengerRNA)序列的3’非翻譯區(qū)或編碼區(qū)結合在轉錄后水平調(diào)控基因的表達。miRNA參與了細胞凋亡、代謝、分化、激素分泌等生理過程。近年發(fā)現(xiàn)，miRNA也在腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理過程發(fā)揮重要作用，并在病毒感染性疾病中與病毒的感染、清除、復制等過程密切相關。
　　 miR-375是一個研究較為廣泛的miRNA。在我們

3、以往的宮頸癌組織miRNA芯片研究中發(fā)現(xiàn)，miR-375在宮頸癌組織中與正常組織相比明顯下調(diào)。為了確定miR-375在宮頸癌進展過程中的作用，本研究首先驗證miR-375在宮頸癌和正常組織中的表達差異，并比較分析miR-375的表達水平與宮頸癌不良預后因素的相關性。再通過基因功能實驗，探尋miR-375的異常表達在宮頸癌細胞侵襲轉移中的可能作用并確定其發(fā)揮作用的靶基因，以明確miR-375發(fā)揮生物學功能的機制。最后利用組織標本和功能實驗

4、，探討miR-375在宮頸癌中的表達失調(diào)與HR-HPV癌蛋白的相互關系。旨在尋找可用于宮頸癌預后預測和治療靶點的miRNA，為探尋宮頸癌防治新策略提供科學依據(jù)。
　　 第一部分，miR-375在宮頸癌中的表達及意義
　　 目的：
　　 驗證miR-375在宮頸癌組織中表達下調(diào)，探討miR-375與宮頸癌不良預后因素之間的相關性。
　　 方法：
　　 收集宮頸鱗癌組織和正常上皮組織標本，采用Stem

5、-loopRT-PCR和RealtimePCR法檢測170例宮頸鱗癌組織和68例宮頸正常上皮組織的miR-375的表達水平，收集完整并整理病例的臨床病理資料，分析miR-375的表達水平與宮頸癌臨床不良預后因素的相關性。
　　 結果：
　　 1.miR-375在宮頸鱗癌組織的表達水平與宮頸正常上皮組織相比顯著下調(diào)。
　　 2.miR-375表達與FIGO分期、盆腔淋巴結轉移、深間質(zhì)浸潤、陰道壁累及以及脈管浸潤有關

6、。
　　 結論：
　　 1.miR-375的表達水平在宮頸癌組織與正常組織相比顯著下調(diào)。
　　 2.miR-375低表達可能與宮頸癌預后不良因素相關，提示組織miR-375測定可能可以用于預測宮頸癌預后。
　　 第二部分，miR-375靶向轉錄調(diào)控因子Sp1在宮頸癌進展中的機制研究
　　 目的：
　　 明確miR-375對宮頸癌細胞增殖、侵襲等生物學行為的調(diào)控作用，并確定miR-375發(fā)揮

7、功能的靶基因，以揭示miR-375參與宮頸癌進展的作用及分子機制。
　　 方法：
　　 在宮頸癌細胞株Siha和CaSki中，利用細胞轉染技術過表達miR-375或siRNA干擾轉錄調(diào)控因子Sp1的表達，利用MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞技術檢測細胞周期分布，劃痕試驗和Transwell侵襲試驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，并利用RealtimeRT-PCR和WesternBlot的方法檢測Sp1的mRNA和蛋白水平，最

8、后利用雙熒光素酶報告基因的方法確認miR-375與Sp1的靶向關系。
　　 結果：
　　 1.在宮頸癌細胞株中，過表達miR-375可降低Siha和CaSki細胞的增殖能力，并阻滯細胞周期于G1期，使細胞的G1期細胞數(shù)明顯增加，S期細胞數(shù)下調(diào)，抑制細胞劃痕的愈合能力和細胞的侵襲功能。
　　 2.在宮頸癌組織中miR-375表達與Sp1mRNA水平呈負相關，過表達miR-375可下調(diào)Sp1的mRNA水平和蛋白水平。

9、
　　 3.miR-375與含Sp13'UTR區(qū)的雙熒光素酶報告質(zhì)粒共轉染，可下調(diào)熒光素酶的活性，而不影響3'UTR區(qū)突變報告質(zhì)粒的熒光素酶活性。
　　 4.在宮頸癌細胞中，干擾Sp1的表達可抑制Siha和CaSki細胞增殖，阻滯細胞周期于G1期，并抑制細胞的遷移和侵襲能力。
　　 結論：
　　 1.在宮頸癌細胞中，過表達miR-375可抑制細胞增殖、阻滯細胞周期于G1期、并抑制細胞的遷移和侵襲，提示mi

10、R-375表達下調(diào)參與了官頸癌的進展過程。
　　 2.Sp1是miR-375的直接靶基因，miR-375通過靶向Sp1調(diào)控宮頸癌細胞的生物學功能。
　　 第三部分，miR-375表達與病毒HPV16E6、E7相關性探討
　　 目的：
　　 確定細胞miR-375表達與HR-HPV感染及E6/E7表達的相關性，探索HPV病毒蛋白靶向調(diào)控宿主細胞miR-375表達和miR-375靶向調(diào)控病毒癌基因的作用。

11、r>　　 方法：
　　 采用Stem-loopRTPCR的方法檢測不同HR-HPV感染狀態(tài)的宮頸正常上皮組織中的miR-375的表達，利用用HPV16E6/E7表達質(zhì)粒在C33A細胞中表達E6/E7，利用siRNA技術干擾Siha細胞表達E6/E7，檢測不同E6/E7表達水平情況下miR-375的表達水平。同時在Siha細胞過表達miR-375，利用RealtimeRTPCR和WesternBlot法檢測病毒癌基因E6/E7的

12、表達及其下游分子P53、Rb、MCM7蛋白的表達。
　　 結果：
　　 1.在HR-HPV感染和無感染的宮頸正常上皮組織中，miR-375的表達水平無顯著統(tǒng)計學差異。
　　 2.HPV16E6/E7表達質(zhì)粒轉染C33A細胞或E6/E7siRNA干擾Siha細胞引起E6/E7表達上調(diào)或下調(diào)，miR-375的表達水平均無顯著變化。
　　 3.單純HPV16感染的宮頸病變組織中，miR-375的表達與E6/E7

13、mRNA水平呈負相關。
　　 4.在宮頸癌細胞株Siha中，過表達miR-375可下調(diào)E6/E7mRNA及E7和MCM7蛋白水平，并上調(diào)P53、pRB蛋白水平。
　　 5.在HCT-116細胞株中，過表達miR-375，P53、pRB和MCM7的蛋白水平無明顯改變。
　　 結論：
　　 1.在宮頸癌細胞中，上調(diào)miR-375表達可抑制E6/E7的表達，并影響其下游分子P53、Rb及MCM7的表達。