持續(xù)驚厥后大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞激活反應(yīng)及相關(guān)調(diào)控因素研究.pdf

1、第一部分持續(xù)驚厥后大鼠海馬神經(jīng)再生與凋亡的動(dòng)態(tài)變化目的：探討驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)后大鼠海馬神經(jīng)再生與凋亡的動(dòng)態(tài)變化。 方法：建立成年Wistar鼠30min SC模型，在SC后1天至56天的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)上處死動(dòng)物，處死前1天均腹腔注射5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine，BrdU)；采用免疫組織化學(xué)方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)BrdU、nestin的表達(dá)，確定神經(jīng)干細(xì)胞(neu

2、ral progenitor/stem cells，NPCs)增殖水平；雙重?zé)晒馊旧珮?biāo)記nestin/TUNEL，確定新生神經(jīng)干細(xì)胞存活狀態(tài)。 結(jié)果：正常成年鼠海馬區(qū)，存在少量BrdU陽(yáng)性細(xì)胞；SC后1天，CA1區(qū)和齒狀回的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞即開(kāi)始顯著升高，與對(duì)照組相比，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目于SC后第7天在CA1區(qū)達(dá)增殖高峰，28天降至正常水平；于SC后第28天在齒狀回達(dá)增殖高峰，56天降至正常水平；在SC后第7天，CA3區(qū)有大量

3、的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。BrdU和nestin性細(xì)胞的空間分布是一致的，陽(yáng)性數(shù)目無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在SC后的前3天，CA1區(qū)新增殖的神經(jīng)細(xì)胞呈TUNEL，陽(yáng)性；齒狀回新增殖細(xì)胞始終表現(xiàn)TUNEL陰性。結(jié)論：SC后能激活海馬自體NPCs原位增殖，并且部分新生細(xì)胞可能向海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷區(qū)域發(fā)生遷移。 第二部分體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的興奮性與電生理特征目的：觀察體外分離培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(neuralprogenitor/stem c

4、ells，NPCs)的興奮性及電壓門控通道表達(dá)。 方法：無(wú)血清培養(yǎng)方法體外分離、純化孕15～16天Wistar胎鼠的海馬NPCs，nestin免疫熒光染色及血清促分化檢測(cè)NPCs的干細(xì)胞特性；以接種于多聚賴氨酸包被玻片上6～24h的第二代NPCs為研究對(duì)象，經(jīng)DiBAC4(3)染色后，用含50μM KCI的細(xì)胞外液刺激，激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)NPCs的膜興奮性；采用膜片鉗電流鉗記錄模式，記錄NPCs的自發(fā)放電和動(dòng)作電位；采用電

5、壓鉗記錄模式，檢測(cè)NPCs的電壓門控離子通道表達(dá)。 結(jié)果：無(wú)血清培養(yǎng)基體外可獲得高純度的海馬NPCs，形成神經(jīng)球，可傳代培養(yǎng)3～4代；NPCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白nestin，且可分化為Tuj-1免疫反應(yīng)陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞；接種于多聚賴氨酸包被的玻片上6～24小時(shí)的第二代NPCs仍表現(xiàn)干細(xì)胞特性；采用DiBAC4(3)染色，含高濃度鉀的細(xì)胞外液刺激后，NPCs膜電位無(wú)顯著改變；在電流鉗模式下，未能檢測(cè)

6、到NPCs的自發(fā)放電，未能誘發(fā)動(dòng)作電位；在電壓鉗模式下，未記錄到NPCs的鈉電流，但記錄到到外向延遲整流鉀電流及外向瞬時(shí)鉀電流兩種鉀電流。結(jié)論：采用無(wú)血清培養(yǎng)方法，在體外成功分離大鼠海馬NPCs；大鼠海馬NPCs不易興奮，可能與其僅表達(dá)鉀電流而無(wú)鈉電流表達(dá)有關(guān)。第三部分腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖及分化的影響目的：探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)對(duì)海

7、馬神經(jīng)干細(xì)胞(neural progenitor/stern cells，NPCs)的存活、增殖及分化的影響。 方法：采用無(wú)血清培養(yǎng)基體外分離、純化、擴(kuò)增胎鼠海馬NPCs。采用神經(jīng)球計(jì)數(shù)及神經(jīng)球直徑測(cè)定觀察BDNF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有無(wú)促增殖作用，并篩選出在適當(dāng)細(xì)胞密度下，促進(jìn)NPCs增殖的有效濃度；采用TUNEL染色及全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的含量探討B(tài)DNF對(duì)

8、海馬NPCs存活的影響；采用抗-Tuj-1染色檢測(cè)NPCs分化成神經(jīng)元的百分率，同時(shí)測(cè)定分化神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度。 結(jié)果：體外分離培養(yǎng)的海馬NPCs表現(xiàn)為nestin免疫染色陽(yáng)性，具有自我增殖能力，且能分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL時(shí)，10～200ng/mL的BDNF能顯著促進(jìn)NPCs的增殖，其中40ng/mL的BDNF促增殖作用最強(qiáng)；40ng/mL BDNF能顯著增大神經(jīng)球直徑，顯著減少NPCs的凋亡率

9、(TUNE+/DAPI+)，抑制LDH漏出。40ng/mL BDNF也能顯著促進(jìn)NPCs分化為Tuj-1免疫染色陽(yáng)性神經(jīng)元，且分化后神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于對(duì)照組。 結(jié)論：BDNF促進(jìn)海馬NPCs的存活、增殖及向神經(jīng)元方向分化。 第四部分持續(xù)驚厥后海馬內(nèi)谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用目的：探討驚厥持續(xù)狀態(tài)(status convulsion，SC)后海馬內(nèi)谷氨酸(glutamate，Glu)含量的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)海馬

10、神經(jīng)干細(xì)胞(neuralprogenitor/stem cells，NPCs)的體外調(diào)控作用。 方法：建立SC動(dòng)物模型，在SC后1～7天內(nèi)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，高效液相色譜法檢測(cè)海馬內(nèi)Glu含量的動(dòng)態(tài)變化；體外分離、純化海馬NPCs，采用免疫熒光和Western blot檢測(cè)N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)的必需亞單位NR1的表達(dá)；采用Fluo-3/A

11、M鈣成像技術(shù)及細(xì)胞單通道記錄技術(shù)研究NPCs表達(dá)的NMDAR是否具有一定功能；采用TUNEL染色及全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定含不同濃度Glu和MK-801細(xì)胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的含量，探討NPCs上NMDAR激活是否介導(dǎo)神經(jīng)興奮毒性作用；采用神經(jīng)球計(jì)數(shù)及神經(jīng)球直徑測(cè)定觀察Glu對(duì)NPCs增殖的影響。結(jié)果：SC后1天，海馬內(nèi)的Glu含量即開(kāi)始升高，在SC后第3天達(dá)高峰，SC后第7天降至正常水

12、平；免疫熒光和Western blot的結(jié)果均顯示NPCs表達(dá)NR1；NMDA刺激后，F(xiàn)luo-3/AM Ca2+成像結(jié)果顯示NPCs細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+含量明顯升高，單通道細(xì)胞貼附式記錄顯示NPCs表達(dá)三種形式的電流：典型的單極矩形脈沖式發(fā)放、閃爍現(xiàn)象、爆發(fā)式開(kāi)放和簇狀開(kāi)放；在30μM MK-801和0～1600μM Glu共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，1600μM Glu組培養(yǎng)上清液中LDH顯著增高，而其他各組無(wú)差別；各組的凋亡水平無(wú)顯著差別；在3