統(tǒng)合分析方法探討EB病毒相關的鼻咽癌細胞轉化機制.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是一種來源于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤，死亡率在癌癥中排第8位。好發(fā)于中國和東南亞地區(qū)，80％的NPC發(fā)生在我國，發(fā)病率居世界之首。NPC的發(fā)病具有地方性和種族特異性，目前研究表明NPC的發(fā)生與飲食習慣、環(huán)境因素、遺傳易感性和EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)感染相關。研究表明，大部分低分化鱗癌和幾乎所有未分化鱗癌均可發(fā)現(xiàn)EBV感染。 EBV屬皰疹

2、病毒科γ亞型，主要含線性雙鏈DNA，約172,000堿基，由末端重復序列、單一序列和內部重復序列組成。約有84個ORFs，編碼80余種蛋白，大多數基因產物與病毒復制相關。EBV生活周期分為潛伏期、立早期、早期和晚期，不同階段表達不同的蛋白質，發(fā)揮不同的作用。BKRF1基因編碼的EBV核抗原(EBV’snucleicantigene，EBVNA)1是維持潛伏狀態(tài)的必須蛋白；BNLF1編碼的潛伏膜蛋白1(latentmembraneprot

3、ein1，LMP1)是唯一具有瘤功能的蛋白；由BZLF1基因編碼的Z蛋白(Zebra)是病毒進入裂解狀態(tài)的重要蛋白。 LMP1主要通過NF-κB、AP-1以及JAK／STAT等信號途徑發(fā)揮作用，抑制B淋巴細胞程序性死亡、增強癌基因bcl-2的表達、并不斷刺激細胞生長信號的傳遞，使細胞的生長失去控制，無限增殖并向惡性轉化。Z蛋白在EBV從潛伏周期進入繁殖(裂解)周期的過程中起關鍵作用，為病毒的復制、晚期結構蛋白的表達打下基礎。裂解

4、復制可阻遏細胞從G1期進入S期，是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。 隨著人類基因組測序計劃的完成，大量微陣列表達數據的積累，以及應運而生的生物信息學的發(fā)展給腫瘤分子發(fā)病機理的研究開闊了新的研究思路、開辟了新的道路。生物信息學是一門由計算機技術、統(tǒng)計學、數學、遺傳學、分子生物學、醫(yī)學、信息學、生物物理和化學等結合的交叉學科。一般意義上，生物信息學是研究生物信息的采集、處理、存儲、傳播、分析和解釋等各方面的一門學科，它通過綜合利用生物學、計算機

5、科學和信息技術來揭示大量而復雜的生物數據所賦有的生物學奧秘。它的研究重點主要體現(xiàn)在基因組學(Genomics)和蛋白組學(Proteomics)兩方面。通過對DNA序列的統(tǒng)計計算分析，更加深入地理解DNA序列、結構、演化及其與生物功能之間的關系，以揭示基因組信息結構的復雜性及遺傳語言的根本規(guī)律。以生物芯片為研究基礎，以序列比對、統(tǒng)計分析方法、可視化作圖、生物聚類、通路分析及啟動子預測等方法為手段，在分子水平進行數據挖掘、對疾病進行闡述。

6、利用基因芯片技術和生物信息學方法系統(tǒng)分析腫瘤相關基因及調控機制，是當前功能基因組學的重要研究途徑，可從整體的、基因組水平上闡明腫瘤細胞基因表達調控網絡。最近，綜合使用各種分析手段對芯片表達數據進行分析的統(tǒng)合分析方法(meta-analysis)成為研究者們的熱點，這種分析方法不僅降低了錯誤發(fā)現(xiàn)率(falsediscoveryrate，F(xiàn)DR)，還克服了單個芯片數據或單個實驗室數據存在的缺陷，從而更加全面地從整體上對疾病進行研究。

7、 本研究以EBV感染NPC的三組數據(GSE2370，GSE2371，GSE6472)和EBV感染原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma，PEL)的數據(GSE2149)為分析材料，采用GeneSpring軟件篩選EBV復發(fā)感染NPC芯片數據的靶標基因，BRBArrayTools軟件篩選EBV+／EBV--NPC和EBV+/EBV--PEL芯片數據的差異基因，再結合轉錄因子及轉錄因子結合位點(Transcri

8、ptionalfactorbindingsite，TFBS)預測、文獻挖掘、基因組織選擇性分析和基因亞細胞定位等方法對目標基因及其相互作用關系進行預測，從中發(fā)現(xiàn)鼻咽癌發(fā)病相關基因，構建差異基因相互作用的網絡圖譜并提出假說，為EBV+-NPC的分子發(fā)病機制、藥物研發(fā)及治療等更深入的課題提供有意義的探索和依據。主要分為以下三部分： 第一部分：EBV活化復發(fā)感染對NPC基因表達模式的影響。以EBV原發(fā)感染NPC的兩組芯片數據(GSE2

9、370：EBV--NPC／正常鼻粘膜上皮組織；GSE2371:EBV+／EBV--NPC)和EBV不同活化次數NPC的芯片數據(GSE6472：P1/R1／P15／R15)為研究材料，導入GeneSpringGX軟件篩選差異基因，然后交叉比較三組數據，得到不同活化次數的NPC差異基因。利用生物學功能聚類、KEGG通路分析、功能注釋和TFBS預測等方法對差異基因進行生物學分析和網絡圖譜的構建。結果篩選到87個EBV感染時的靶標基因和116

10、個復發(fā)感染時的差異基因，交叉比較后，獲得23個差異基因(meta-A)在兩組數據中共同表達，作為EBV活化時復發(fā)感染的靶標基因，可能通過兩種表達模式(expressionpatterns)發(fā)揮作用：一條主要涉及TOP1，DUSP1，DUSP6和RPS28等，另一條是由PITX1，CD9,HOXA9和IMPDH2組成的轉錄相關環(huán)。 第二部分：以EBV+／EBV--NPC(GSE2371)和EBV+／EBV-PEL(GSE2149)

11、兩組數據為分析材料研究EBV感染導致不同腫瘤的共同發(fā)生通路。同樣是EBV感染，最后可能發(fā)生不同的腫瘤，交叉比較這些數據，可能獲得EBV感染致腫瘤的一條共同通路，有助于理解EBV感染致鼻咽癌的發(fā)生機制。從NCBI的GEO數據庫下載數據后，將其導入至BRB-ArrayTools分析軟件進行標準化及差異基因的篩選和統(tǒng)計學分析，交叉比較兩組差異基因，結果獲得了45個侯選基因(meta-B)。對meta-B基因進行生物學功能聚類、通路分析、TFB

12、S預測等，結果發(fā)現(xiàn)meta-B基因主要涉及LMP1調節(jié)的AP-1，NF-κB和JAK／STAT三條信號通路，細胞周期及BZLF1誘導通路，RB／E2F，CDKN1A，DEK和P53的表達改變，可能參與EBV相關的腫瘤細胞的轉化過程。 第三部分：構建EBV感染相關的NPC的轉錄調控網絡圖譜，并提出假說。結合以上兩部分的結果，將兩個圖譜中的重要節(jié)點如：DEK，E2F，RB，LMP1，BZLF1，JUN，NF-κB和MYC等進行反復的

13、文獻挖掘，并交叉比較淋巴結組織選擇性基因及基因亞細胞定位分析。結果發(fā)現(xiàn)EBV感染相關的分子作用通路根源于LMP1和BZLF1。由PITX1，CD9，HOXA9和IMPDH2組成的轉錄相關環(huán)可以通過SP1，STAT3相互聯(lián)系，BZLF1誘導的RB，E2F和DEK表達改變可能是腫瘤發(fā)生的一重要調節(jié)通路。綜合文獻挖掘的結果，我們提出EBV感染相關鼻咽癌發(fā)生機制的假說：EBV潛伏感染時，LMP1等占主導的作用，刺激細胞增長、抑制凋亡、阻止裂解復

14、制。EBV活化時，多種因素(P53過表達，γ射線等)可誘導BZLF1表達，高表達的BZLF1通過CDKN1A和P27抑制CDK2的表達，低磷酸化RB／E2F復合物不能釋放出E2F，DEK表達下降，激活P53的活性，使細胞進入裂解復制、釋放出大量的病毒粒子，進而感染更多的宿主細胞，使細胞發(fā)生轉化及侵襲能力增強，最終導致宿主細胞死亡和腫瘤的發(fā)生及轉移。 綜上所述，統(tǒng)合分析的生物信息學方法成功地對EBV相關的四組數據進行了分析和研究，

15、篩選獲得了兩組特征性差異基因(包括meta-A：EBV原發(fā)感染和復發(fā)感染NPC的差異基因；和meta-B：在EBV依賴的NPC和PEL中同時差異表達基因)，并在此基因及轉錄因子基礎上構建了一個EBV感染相關的鼻咽癌細胞轉化的網絡調節(jié)圖譜。進一步探討了EBV感染相關腫瘤的可能目標基因及其相互調節(jié)關系，并提出了EBV活化復發(fā)感染致腫瘤細胞轉化的假說：NPC的形成和發(fā)展可能依賴從潛伏進入裂解周期時DEK，CDK，P53，RB和相關轉錄因子等的