基于鴨疫里黙氏桿菌表面抗原D15的乳膠凝集試驗方法建立及其單克隆抗體的制備.pdf

1、目前，還未見到有關鴨疫里黙氏桿菌(RA)表面抗原D15截短蛋白的深入研究報道。本試驗通過對本實驗室在NCBI GenBank注冊的Riemerella anatipestifer D15基因（登錄號為CP003787）進行了生物信息學分析，對D15基因N端的主要抗原域進行了克隆和原核表達、重組蛋白純化和多克隆抗體制備、檢測鴨疫里黙氏桿菌抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗的建立、RAD15截短蛋白單克隆抗體的制備及初步鑒定，結果如下:

2、r>　　1.D15基因的生物信息學分析
　　通過對D15基因及其編碼蛋白的結構、抗原性、功能位點以及稀有密碼子等進行了全面的生物信息學分析，結果顯示RAD15基因包含2個保守結構域，與多種黃桿菌屬同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有較高的同源性。其編碼產(chǎn)物含有信號肽、1個跨膜區(qū)，可以定位于細胞外膜，抗原表位較多且在N端相對較多，不含有多個連續(xù)的稀有密碼子。
　　2.D15 N端基因的克隆、原核表達及多克隆抗體制備
　　在上述

3、分析基礎上克隆了該基因并利用原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)，表達了部分ORF編碼產(chǎn)物（完整ORF編碼產(chǎn)物不表達），經(jīng)SDS-PAGE分析表明融合蛋白大小約為34 kDa，Western blot表明，表達產(chǎn)物可與兔抗RA全菌多克隆抗體發(fā)生特異性免疫反應。采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠層析柱純化重組蛋白，免疫動物制備了RAtD15多克隆抗體，瓊擴效價為1∶16。凝集實驗表明制備的抗血清能與RA CH-1株全菌發(fā)生特異性反應。
　　3.

4、檢測鴨疫里黙氏桿菌抗體的重組tD15蛋白乳膠凝集試驗的建立
　　目前，還未見到通過建立構建重組tD15蛋白乳膠凝集試驗來檢測RA的研究報道。本試驗采用Ni-NTA瓊脂糖凝膠層析柱純化pET-28a-tD15原核表達蛋白，以羧化乳膠為載體經(jīng)化學交聯(lián)法致敏乳膠，對致敏條件優(yōu)化后的乳膠進行質量檢測。結果顯示在pH7.4的PBS緩沖液中，乳膠濃度為1％、蛋白質量濃度為0.225 mg/mL、偶聯(lián)6h后制備的致敏乳膠凝集反應最好;致敏乳膠抗

5、原無自凝現(xiàn)象;與鴨傳染性腫頭癥、鴨病毒性肝炎、鴨流行性感冒、鴨大腸桿菌病、鴨沙門氏菌病，鴨病毒性腸炎陽性血清不發(fā)生凝集;批內重復、批間重復試驗很穩(wěn)定;陽性血清的敏感性為1∶256。對比試驗中建立的LAT方法與本實驗室已建立的ELISA方法的符合率為80％，2種方法檢測的結果基本一致。研究結果表明，乳膠凝集方法具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、價格低廉且可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，是一種適合基層獸醫(yī)單位用于鴨疫里黙氏桿菌(RA)血清抗體檢

6、測的新方法。
　　4.D15截短蛋白的單克隆抗體的制備及初步鑒定
　　制備抗RA tD15蛋白的單克隆抗體并對其特性進行鑒定。應用純化復性的重組tD15蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0融合，應用有限稀釋法篩選出抗RAtD15重組蛋白的陽性雜交瘤細胞株;采用腹水誘生法制備單抗腹水，用飽和硫酸銨法純化腹水抗體;采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞以及測定單克隆抗體的特性、效價及其相對親和力。獲得2株抗RA

7、tD15蛋白的陽性雜交瘤細胞株，命名為4＃、16＃，2株細胞株經(jīng)反復凍存復蘇，體外傳代仍能穩(wěn)定分泌抗體;4＃單克隆抗體屬于IgG1，κ鏈;16＃單抗單克隆抗體屬于IgG2b，κ鏈;4＃雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價為1∶3200，腹水效價為1∶12800，16＃雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價為1∶6400，腹水效價為1∶204800;2株單克隆抗體均能夠識別大小約為34 kDa的蛋白，說明兩種單克隆抗體是特異性識別tD15蛋白的抗體;兩種單抗能夠與鴨疫