棉花體細(xì)胞胚發(fā)生與合子胚發(fā)育相關(guān)基因的鑒定、克隆與功能分析.pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞向胚胎發(fā)生途徑轉(zhuǎn)變的發(fā)育再建過(guò)程，是植物發(fā)育過(guò)程中的獨(dú)特現(xiàn)象，也是細(xì)胞全能性的有力證據(jù)和經(jīng)典示例。體細(xì)胞胚胎發(fā)生現(xiàn)象被看作是開(kāi)展生物學(xué)理論研究的良好模型。研究棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生對(duì)于闡明植物發(fā)育的分子機(jī)理，促進(jìn)作物的遺傳工程改良，無(wú)論在基礎(chǔ)理論還是在實(shí)際應(yīng)用價(jià)值上都具有極其重要的意義。 1．比較研究了棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)和內(nèi)源生化因子動(dòng)態(tài)變化。首先，通過(guò)形態(tài)特征從棉花組織培養(yǎng)中鑒定出了有效胚性能力

2、的細(xì)胞系，從而建立有效的再生體系。在細(xì)胞水平，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定了棉花體細(xì)胞脫分化、再分化過(guò)程中兩次染色體解旋的細(xì)胞學(xué)特征標(biāo)記。同時(shí)，對(duì)體胚發(fā)生內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)測(cè)定表明，細(xì)胞內(nèi)源生長(zhǎng)素IAA及生長(zhǎng)素與分裂素比值的急劇增加是非胚性細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的一個(gè)顯著的生化特征。研究表明，兩次染色體解旋的細(xì)胞學(xué)活動(dòng)同內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化有著共同的規(guī)律和特點(diǎn)，是緊密聯(lián)系的，是棉花整個(gè)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中脫分化、再分化的細(xì)胞學(xué)和生化基礎(chǔ)。

3、 2．實(shí)現(xiàn)了體胚發(fā)生重要基因資源的成功挖掘，并全面分析了棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，揭示了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的分子基礎(chǔ)。為了分離參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程有關(guān)的基因，采用SSH技術(shù)分離了在胚性愈傷組織和各時(shí)期胚狀體中差異表達(dá)的ESTs。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)兩套差異篩選程序和反向Northern blot分析，最終分離鑒定獲得了671個(gè)差異表達(dá)的cDNA片段，代表了242個(gè)非冗余基因，囊括了以往植物界在本領(lǐng)域研究中分離的體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的大

4、部分基因，而且一半以上的基因沒(méi)有在以前的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究中報(bào)道過(guò)。其中大約1/3胚胎發(fā)生有關(guān)基因是在GenBank中不存在的未知新基因。尤其重要和感興趣的是分離鑒定了很多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，它們很可能在啟動(dòng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中起重要作用。又通過(guò)cDNA array技術(shù)系統(tǒng)地對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生差異表達(dá)的相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)譜分析，涉及了體胚分化發(fā)育整個(gè)過(guò)程，包括胚性細(xì)胞分化前后及隨后胚胎發(fā)育的典型時(shí)期(球前原胚、球形胚、心形胚、

5、魚(yú)雷胚、子葉胚)。揭示了這一發(fā)育過(guò)程中存在的幾類(lèi)不同基因類(lèi)群及其特異的表達(dá)模式，全面闡明了這一獨(dú)特的生物發(fā)育過(guò)程中的基因特異和有序表達(dá)的特點(diǎn)。通過(guò)Northern雜交和RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了不同類(lèi)型的基因類(lèi)群在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期特異表達(dá)模式。 3．研究了棉花合子胚形態(tài)發(fā)育進(jìn)程，鑒定了各個(gè)發(fā)育時(shí)期的合子胚，構(gòu)建了六個(gè)與棉花生殖發(fā)育相關(guān)的差減文庫(kù)。包括配子、合子胚、胚乳發(fā)育特異表達(dá) cDNA文庫(kù)及體胚與合子胚發(fā)育差異表達(dá) cDNA

6、文庫(kù)。重點(diǎn)比較了合子胚發(fā)育起始與體細(xì)胞胚發(fā)育早期(胚性起始) 相關(guān)基因表達(dá)譜特點(diǎn)，研究了兩者發(fā)育起始在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上所存在的分子基礎(chǔ)共性和差異。通過(guò)鑒定差異表達(dá)基因并結(jié)合生物信息學(xué)分析表明：在細(xì)胞成分、生物過(guò)程、分子功能和可能參與的代謝途徑方面，體胚和合子胚發(fā)育的相關(guān)基因的表達(dá)都具有非常相似的規(guī)律，整體基因表達(dá)和代謝過(guò)程都存在極大的相似性。即兩者具有相似的形態(tài)發(fā)育過(guò)程和分子基礎(chǔ)，也證明了體細(xì)胞胚的確可以作為合子胚發(fā)育研究的良好實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

7、型。當(dāng)然，比較也發(fā)現(xiàn)兩者的基因表達(dá)也存在一些不同的地方，兩者有著各自特異的功能基因表達(dá)和生物代謝過(guò)程。 4．借助模式植物擬南芥基因組挖掘預(yù)測(cè)了生長(zhǎng)素應(yīng)答基因，對(duì)其進(jìn)行了基因組注釋及功能分類(lèi)、Gene Ontology等相關(guān)生物信息學(xué)分析。通過(guò)檢索相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，評(píng)估了這一系列假想的生長(zhǎng)素應(yīng)答基因。大概有65.2％的候選基因能夠被證實(shí)。該結(jié)果和研究數(shù)據(jù)能夠大大降低基因組中候選生長(zhǎng)素應(yīng)答基因的數(shù)目并為很多未知基因提供注釋。更為挖掘

8、新的體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)激素應(yīng)答基因提供了基礎(chǔ)。 5．體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程是一個(gè)多因子參與的表達(dá)調(diào)控復(fù)雜而又協(xié)同有序互作的分子網(wǎng)絡(luò)整體。為了尋找和預(yù)測(cè)新的體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因，更深的挖掘和理解這一生物過(guò)程，利用鑒定的體胚發(fā)生相關(guān)基因和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法構(gòu)建了富含體胚發(fā)生相關(guān)因子的分子調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)了很多生物調(diào)控路徑。通過(guò)檢索體胚發(fā)生文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估。很多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了這一方法和結(jié)果的有效性。通過(guò)構(gòu)建基因

9、網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡和細(xì)胞分裂增殖是參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生這個(gè)獨(dú)特生物過(guò)程的兩個(gè)顯著過(guò)程，是體胚發(fā)生這一復(fù)雜而有序生物過(guò)程的核心標(biāo)志。可以解釋為：兩者相互協(xié)調(diào)又相互制約的關(guān)系很可能決定了體細(xì)胞在胚胎發(fā)生過(guò)程中的命運(yùn)。不同激素之間的復(fù)雜的互作和動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系是體胚發(fā)生中的另一個(gè)顯著特征，而且它們以不同的調(diào)控方式作用于細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡這兩個(gè)過(guò)程。這就表明體胚發(fā)生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含了極其復(fù)雜的分子調(diào)控關(guān)系和生物過(guò)程。這一草圖為以后的胚胎發(fā)生分子機(jī)制和系統(tǒng)

10、生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ)平臺(tái)和參考資料。 6．分離克隆了一系列體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)候選基因的全長(zhǎng)cDNA和部分基因啟動(dòng)子，通過(guò)高通量的功能驗(yàn)證手段研究了這些重要基因的表達(dá)、功能和亞細(xì)胞定位信息。利用gateway系列載體(重組技術(shù))大量構(gòu)建了超量表達(dá)載體和RNAi載體，對(duì)前面實(shí)驗(yàn)鑒定和構(gòu)建的基因網(wǎng)絡(luò)草圖中發(fā)掘的重要標(biāo)記基因其進(jìn)行了功能驗(yàn)證。一些候選基因在功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)了明顯的預(yù)期功能表型。進(jìn)一步對(duì)系列基因的啟動(dòng)子表達(dá)特點(diǎn)和細(xì)胞瞬時(shí)