番茄SlHDA1-SlHDA3基因的克隆及在果實(shí)發(fā)育成熟過程中的功能研究.pdf

1、組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎検钦婧松镏匾谋碛^遺傳調(diào)控方式之一，通過對(duì)組蛋白 N端末尾的修飾，達(dá)到調(diào)控真核生物基因表達(dá)的作用。組蛋白去乙?；福℉DACs）介導(dǎo)的乙?；揎椩谥参锷L發(fā)育及基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，擬南芥中組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椩谌旧w穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、植物發(fā)育及對(duì)外界脅迫響應(yīng)方面具有重要作用，但對(duì)果實(shí)發(fā)育與成熟的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制還不清楚。番茄(Solanum lycopersicum)作為研究果實(shí)

2、發(fā)育和成熟的理想模式植物，在果實(shí)相關(guān)的研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明SlHDA1和SlHDA3在番茄果實(shí)破色和成熟期表達(dá)量較高，可能參與果實(shí)成熟過程。由此，本論文以番茄作為研究材料，研究番茄組蛋白去乙?；讣易宄蓡TSlHDA1、SlHDA3對(duì)果實(shí)發(fā)育與成熟過程的影響，以期為揭示SlHDA1、SlHDA3對(duì)果實(shí)發(fā)育成熟的調(diào)控作用和相應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為改善番茄果實(shí)品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。
　　本研究從番茄基因組中分離出SlHDA

3、1和SlHDA3兩個(gè)去乙?；富?，分析其基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守功能域，構(gòu)建了HDACs家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹；分別對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，分析其在番茄中的時(shí)空特異表達(dá)模式；通過啟動(dòng)子區(qū)域的元件分析、相應(yīng)的激素和非生物脅迫處理，分析二者在相應(yīng)條件下的表達(dá)模式；同時(shí)，構(gòu)建了SlHDA1和SlHDA3基因的超表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化番茄，初步鑒定了轉(zhuǎn)基因株系的表型；并通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出與SlHDA1和SlHDA3蛋白互作的果

4、實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；初步研究了SlHDA1和SlHDA3基因在番茄果實(shí)發(fā)育和成熟過程中的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下：
　　一、通過對(duì)SlHDA1、SlHDA3基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，SlHDA1基因全長1497bp，含有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，編碼498個(gè)氨基酸；SlHDA3基因全長1416bp，含有6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，編碼471個(gè)氨基酸。對(duì)兩個(gè)蛋白的保守功能域分析發(fā)現(xiàn)，SlHDA1和SlHDA3蛋白具有典型的精氨酸酶功能域

5、和組蛋白去乙酰化酶功能域，且存在多個(gè)活性部位及金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。
　　二、通過將番茄SlHDA1、SlHDA3基因編碼區(qū)序列與GFP基因融合，構(gòu)建用于亞細(xì)胞定位的融合表達(dá)載體Sl-HDA1/HDA3:GFP，并轉(zhuǎn)化煙草懸浮細(xì)胞BY2原生質(zhì)體，通過瞬時(shí)表達(dá)，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)融合表達(dá)載體的GFP熒光在煙草BY2細(xì)胞中的位置進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)番茄SlHDA1、SlHDA3基因所編碼蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。
　　三、通過在線分析和定量

6、PCR方法對(duì)番茄SlHDA1、SlHDA3基因的時(shí)空特異性表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明SlHDA1、SlHDA3基因的表達(dá)具有組織特異性，均在花器官及果實(shí)中的表達(dá)量相對(duì)較高；在果實(shí)的發(fā)育階段，兩個(gè)基因均在破色時(shí)期和果實(shí)成熟后期有較高的表達(dá)量。
　　四、對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域存在與茉莉酸甲酯（MeJA）和赤霉素（GA3）及一些與逆境相關(guān)的響應(yīng)元件。通過相應(yīng)的激素和脅迫處理分析兩個(gè)基因的響應(yīng)模式，發(fā)現(xiàn)SlHDA1基因的

7、表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到赤霉素和茉莉酸甲酯的調(diào)控，SlHDA3基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受到赤霉素的調(diào)控；脅迫處理結(jié)果表明SlHDA1和SlHDA3可能參與植物體對(duì)外界溫度及鹽脅迫的響應(yīng)過程。
　　五、通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因的超表達(dá)株系中均出現(xiàn)番茄果實(shí)變小及種子數(shù)量減少的表型，而SlHDA3 RNAi抑制表達(dá)株系的果實(shí)出現(xiàn)表面色素分布不均的現(xiàn)象，且成熟后始終呈橙紅色。初步推測SlHDA1和SlHDA3去乙?；缚赡軈⑴c調(diào)

8、控果實(shí)發(fā)育和種子形成過程，且SlHDA3可能還參與調(diào)控番茄果實(shí)色素的合成與分布。
　　六、篩選部分果實(shí)發(fā)育成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子與SlHDA1和SlHDA3進(jìn)行蛋白互作分析，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRAS家族的SlGRAS9和SlGRAS40兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均能與兩個(gè)去乙?；赴l(fā)生互作，且鋅指蛋白家族的SlZF1可與SlHDA1互作。由此推測，SlHDA1和SlHDA3可能分別通過與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)控下游基因表達(dá)，從而在番茄