胰島素介導(dǎo)SHR VSMC增殖的基因外修飾機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景： 大量研究證實(shí)高血壓合并糖尿病及高胰島素血癥的病人，發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大高于單純高血壓病人，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與基礎(chǔ)研究證實(shí)：1、胰島素可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)脈硬化的發(fā)生；2、在超生理濃度下，胰島素刺激血管平滑肌細(xì)胞的增生和遷移；3、長(zhǎng)期給與外源胰島素導(dǎo)致脂異常與動(dòng)脈壁增厚；4、胰島素輸注加速了輸注動(dòng)脈的粥樣硬化。提示胰島素抵抗及其代償性的高胰島素血癥是冠心病的重要危險(xiǎn)因素，在冠心病和血管增生性疾病的預(yù)防和治療過(guò)程中也說(shuō)明

2、高胰島素血癥在血管增生性病變中發(fā)生重要作用。積極改善胰島素抵抗和高胰島素血癥，對(duì)以上的疾病將起到積極的防治作用。 二、研究目的： 明確結(jié)構(gòu)基因外修飾對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)換的影響，找出胰島素介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞異常增殖時(shí)基因外改變(結(jié)構(gòu)基因外修飾)調(diào)控細(xì)胞增殖的變化規(guī)律及結(jié)構(gòu)基因外修飾和細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)差異之間的內(nèi)在聯(lián)系及作用機(jī)制，揭示血管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，為血管增生性疾病的防治尋求新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 三、研究?jī)?nèi)容： 1.胰島素促SHR VSMCs增殖的MAPK機(jī)制。 2.丁酸鈉阻斷HDAC后組蛋白超乙?；瘜?duì)SHR VSMCs增殖的影響。 3.胰島素對(duì)組蛋白乙?；挠绊?，PD98059阻斷MAPK通路后組蛋白乙酰化的改變。 4.胰島素對(duì)HDAC1的作用及PD98059阻斷MAPK后對(duì)這種作用的影響。 5.丁酸鈉導(dǎo)致的組蛋白超乙?；瘜?duì)MAPK通路的影響。 6.胰島素對(duì)增殖相關(guān)因子PDG

4、F基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響及PD98059和丁酸鈉對(duì)胰島素的這種作用的影響。 7.胰島素對(duì)VSMCs表型相關(guān)蛋白質(zhì)α-SM actin、OPN表達(dá)的影響及PD98059和丁酸鈉對(duì)其的作用。 8.胰島素、PD98059、丁酸鈉對(duì)PDGF和α-SM actin DNA啟動(dòng)子甲基化的影響。 四、研究方法： 1.原代培養(yǎng)SHR VSMCs。 2.H3-TdR摻入、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)VSM

5、Cs的增殖情況。 3.建立胰島素促VSMCs增殖的濃度曲線(xiàn)。 4.以胰島素及PD98059干預(yù)VSMC后觀(guān)察VSMCs增殖的情況，免疫印跡和RT-PCR觀(guān)察MAPK蛋白質(zhì)表達(dá)及mRNA表達(dá)的變化。 5.丁酸鈉干預(yù)VSMCs后對(duì)胰島素促VSMC增殖作用的影響。 6.免疫印跡檢測(cè)胰島素、PD98059、丁酸鈉對(duì)VSMCs HDAC1及組蛋白乙?；挠绊憽?7.免疫印跡檢測(cè)胰島素、PD98059、丁酸鈉

6、對(duì)MAPK表達(dá)的影響，RT-PCR檢測(cè)其對(duì)MAPK基因轉(zhuǎn)錄的作用。 8.免疫印跡檢測(cè)胰島素、PD98059、丁酸鈉對(duì)PDGF和α-SM actin表達(dá)的影響，RT-PCR檢測(cè)其對(duì)PDGF和α-SM actin基因轉(zhuǎn)錄的作用。 9.特異性甲基化DNA PCR檢測(cè)胰島素、PD98059、丁酸鈉對(duì)PDGF和α-SM actinDNA啟動(dòng)子甲基化的影響。 五、研究結(jié)果： 1.胰島素能夠明顯促進(jìn)MAPK的表達(dá)及SH

7、R VSMCs增殖，且這種作用能被PD98059阻斷。 2.丁酸鈉能抑制胰島素促進(jìn)SHR VSMCs增殖的作用。 3.胰島素促進(jìn)HDAC1的表達(dá)，丁酸鈉明顯抑制HDAC1的表達(dá)，PD98059對(duì)HDAC1的表達(dá)無(wú)明顯影響。 4.免疫印跡顯示胰島素促進(jìn)組蛋白H3乙?；?，而PD98059抑制胰島素的這種作用。 5.胰島素上調(diào)PDGF的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)α-SM actin的表達(dá)。該作用可被PD98059和丁酸鈉阻

8、斷。 6.胰島素促進(jìn)MAPK、PDGF基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制α-SM actin基因的轉(zhuǎn)錄，該作用可被PD98059和丁酸鈉阻斷。 7.PDGF DNA啟動(dòng)子在SHR VSMCs中生理情況下處于非甲基化狀態(tài)，胰島素、PD98059對(duì)其非甲基化狀態(tài)沒(méi)有影響，但丁酸鈉可以使PDGF DNA啟動(dòng)子發(fā)生甲基化。 8.α-SM actin DNA啟動(dòng)子在SHR VSMCs中生理情況下處于非甲基化狀態(tài)，胰島素、PD98059、