小檗堿靶向性脂質(zhì)體及其抗乳腺癌干細胞作用機制與效應研究.pdf

1、乳腺癌的診斷和治療技術在過去的數(shù)十年中取得了長足的進步,但是,乳腺癌仍然是導致女性死亡率最高的癌癥之一、治療后復發(fā)率高達40％。導致癌癥復發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因之一是腫瘤干細胞在藥物治療、放療或手術治療后仍有少量的殘存,如乳腺癌干細胞。如何在殺傷乳腺癌細胞的同時根除乳腺癌干細胞是提高治療效果的關鍵因素,也是亟待解決的重要科學問題。本研究旨在構(gòu)建一種能夠靶向至乳腺癌干細胞的靶向性載藥脂質(zhì)體,并與細胞毒藥物聯(lián)合應用,以達到在殺傷乳腺癌細胞的同時

2、清除乳腺癌干細胞的目的。在構(gòu)建的載藥系統(tǒng)中,以小檗堿為模型藥,以線粒體靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE( dequalinium polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine)、卵磷脂( egg phosphatidylcholine, EPC)、膽固醇(cholersterol, Chol)等為脂質(zhì)體載體材料制備小檗堿靶向性脂質(zhì)體;同時,構(gòu)建了紫杉醇脂質(zhì)體作為抗

3、癌藥物以與小檗堿靶向性脂質(zhì)體聯(lián)合應用,旨在殺傷腫瘤細胞的同時,從線粒體水平上誘導腫瘤干細胞凋亡,根除腫瘤干細胞。
　　本文第一部分是文獻綜述,對國內(nèi)外相關研究文獻與進展進行了調(diào)研和評述。本部分從腫瘤干細胞的起源、腫瘤干細胞的生物學特征和鑒定方法、腫瘤干細胞的靶向治療策略、脂質(zhì)體在抗腫瘤藥物納米輸送系統(tǒng)中的應用、小檗堿、地喹氯銨等六個方面進行文獻調(diào)研。文獻研究表明,以線粒體為作用靶點,以本實驗室合成的具有長循環(huán)性能及線粒體靶向性材料

4、DQA-PEG2000-DSPE修飾靶向性長循環(huán)納米給藥系統(tǒng),靶向乳腺癌干細胞從線粒體水平上誘導腫瘤干細胞凋亡,可望從根本上克服腫瘤干細胞耐藥及由腫瘤干細胞引起的腫瘤復發(fā)。
　　本文的第二部分是關于小檗堿靶向性脂質(zhì)體的制備工藝和理化性質(zhì)的表征研究。本部分研究中應用本實驗室合成的載體材料DQA-PEG2000-DSPE、EPC、Chol為膜材制備空白靶向性脂質(zhì)體。將小檗堿包封到空白靶向脂質(zhì)體中,構(gòu)建了小檗堿靶向性脂質(zhì)體,同時,構(gòu)建了

5、研究對照用藥小檗堿脂質(zhì)體、聯(lián)合用藥紫杉醇脂質(zhì)體?？疾炝诵￠迚A脂質(zhì)體、小檗堿靶向性脂質(zhì)體、紫杉醇脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率及體外釋放情況。建立了小檗堿和紫杉醇體外HPLC含量測定方法。結(jié)果顯示:(1)合成的靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE平均分子質(zhì)量為3288.8 Da;(2)建立的小檗堿體外HPLC含量測定方法在1.000μg/mL-100.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系,回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度均符合

6、要求;(3)建立的紫杉醇體外HPLC含量測定方法在1.000-100.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系,回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度均符合要求;(4)小檗堿脂質(zhì)體和小檗堿靶向性脂質(zhì)體的粒徑均在96 nm左右,紫杉醇脂質(zhì)體的粒徑在80 nm左右,多分散系數(shù)均小于0.2,Zeta電位呈略電負性;(5)小檗堿脂質(zhì)體、小檗堿靶向性脂質(zhì)體和紫杉醇脂質(zhì)體的包封率均大于90%;(6)體外釋放結(jié)果表明,小檗堿、紫杉醇在最初的2 h內(nèi),釋放率分別低于1

7、0%和11%,24 h后,釋放率分別為35%和30%。
　　在第三部分研究中,采用無血清懸浮培養(yǎng)法體外培養(yǎng)MCF-7干細胞并進行乳腺癌干細胞表型分析,考察小檗堿靶向性脂質(zhì)體對MCF-7干細胞增殖抑制效果和靶向性效應。結(jié)果顯示:(1)可采用無血清懸浮培養(yǎng)法體外篩選MCF-7乳腺癌干細胞,MCF-7乳腺癌干細胞能夠在無血清培養(yǎng)基中以腫瘤球的形態(tài)生長和擴增;(2)腫瘤干細胞表型鑒定結(jié)果表明,細胞表面分子標志為CD44+/CD24-表型的

8、細胞比例占98.77%,MCF-7干細胞球經(jīng)含有血清的完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)72 h后, CD44+/CD24-表型的細胞比例占99.56%,腫瘤干細胞比例基本維持不變;(3)小檗堿靶向性脂質(zhì)體對MCF-7細胞和MCF-7干細胞均有很強的殺傷作用,且與紫杉醇脂質(zhì)體存在協(xié)同增效作用,二者聯(lián)合應用可顯著提高紫杉醇脂質(zhì)體對MCF-7干細胞的殺傷作用;(4)與對照制劑相比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體明顯增加了MCF-7干細胞對藥物的攝取;(5)與對照制劑相

9、比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體在MCF-7干細胞線粒體中有明顯的共定位,能夠?qū)⑿￠迚A集中輸送至乳腺癌干細胞線粒體中。
　　在第四部分研究中,考察了小檗堿靶向性脂質(zhì)體抑制MCF-7乳腺癌干細胞的作用機制。通過ELISA法分別測定了乳腺癌干細胞內(nèi)的五種ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平變化,采用免疫組化法檢測了細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放到胞漿的情況,采用特異的蛋白底物顯色檢測細胞內(nèi)凋亡酶caspase-9和caspase-3的活性以及ELISA法測定Bc

10、l-2家族關鍵蛋白的表達活性。結(jié)果顯示:(1)小檗堿靶向性脂質(zhì)體顯著降低了ABCC1和ABCG2的表達水平、略微下調(diào)了ABCC2和ABCC3的表達水平及上調(diào)了ABCB1的表達水平;(2)小檗堿靶向性脂質(zhì)體選擇性地在線粒體蓄積、激活了促凋亡蛋白Bax表達活性和抑制了抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、可以引起線粒體PT孔開放,細胞色素C從線粒體釋放到胞漿,活化了凋亡酶、引發(fā)caspase-9和其下游的caspase-3活性增強。該項研究證明,小檗

11、堿靶向性脂質(zhì)體能夠調(diào)控乳腺癌干細胞ABC轉(zhuǎn)運蛋白并能從線粒體水平誘導乳腺癌干細胞凋亡。
　　第五部分研究,通過將乳腺癌干細胞異種移植到BALB/c裸鼠體內(nèi)構(gòu)建腫瘤復發(fā)模型,考察了小檗堿靶向性脂質(zhì)體及其與紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合給藥后在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果;采用活體成像技術來觀察熒光染料Cy7標記的靶向性脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布和腫瘤蓄積能力。研究結(jié)果表明:(1)小檗堿游離藥自身約有50%的抑廇率,與小檗堿游離藥或小檗堿脂質(zhì)體相比,小檗堿靶向

12、性脂質(zhì)體可以更為有效的抑制MCF-7乳腺癌干細胞移植瘤的增長,腫瘤的體積抑制率在第21天可達到71.77±8.92%;與紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合用藥后,腫瘤的體積抑制率可達到85.5±9.72%;(2)與對照組制劑相比,小檗堿靶向性脂質(zhì)體給藥組裸鼠的體重并沒有顯著下降和引起血相參數(shù)變化,說明該脂質(zhì)體在裸鼠體內(nèi)毒性較低;(3)Cy7標記的靶向性脂質(zhì)體在腫瘤組織可以觀察到最強的熒光信號,活體成像結(jié)果顯示, Cy7標記的靶向性脂質(zhì)體在裸鼠體內(nèi)24 h

13、時在腫瘤塊部位仍能觀測到強烈的熒光信號。這些研究結(jié)果證明:小檗堿靶向性脂質(zhì)體在動物體內(nèi)可以有效地靶向到腫瘤部位,進而發(fā)揮藥效有效抑制乳腺癌干細胞引起的腫瘤生長或復發(fā)。
　　綜上所述,本研究采用線粒體靶向性材料DQA-PEG2000-DSPE構(gòu)建的小檗堿靶向性脂質(zhì)體與化療藥紫杉醇脂質(zhì)體聯(lián)合用藥,旨在殺傷乳腺癌細胞的同時根除乳腺癌干細胞。以人源MCF-7為細胞模型,采用無血清懸浮培養(yǎng)法獲得MCF-7乳腺癌干細胞。通過細胞增殖抑制實驗、

14、流式細胞儀、激光共聚焦實驗證明了小檗堿脂質(zhì)體能夠增加乳腺癌干細胞對小檗堿的攝取并選擇性地在線粒體蓄積,通過ELISA法、免疫組化法驗證小檗堿脂質(zhì)體能夠有效調(diào)控腫瘤干細胞表面ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平,激活促凋亡蛋白Bax表達活性并抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的活性,可以引起線粒體PT孔開放、促進大量細胞色素C從線粒體釋放到胞漿、激活了凋亡酶,引發(fā)caspase-9和其下游的caspase-3級聯(lián)反應。通過建立乳腺癌干細胞移植瘤模型,評價了小檗