丁苯酞對(duì)血管性癡呆小鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶代謝影響機(jī)制的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VD)由于各種腦血管病引起的獲得性認(rèn)知功能障礙，以學(xué)習(xí)、記憶功能缺損為主要癥狀。隨著社會(huì)人口的日益老齡化和腦卒中治愈率的不斷提高，VD的發(fā)病呈迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)，成為嚴(yán)重危害老年人身心健康的常見(jiàn)疾病，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前VD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，也無(wú)特效的防治方法，因此探討和闡明VD的發(fā)病機(jī)理，對(duì)于臨床制定更加合理的治療方案具有重要的價(jià)值和理論意義。 丁苯酞(dl-3n-

2、butylphthalide NBP)系從食用植物芹菜籽中提取并經(jīng)消旋合成的黃色油狀液體。該藥為國(guó)家治療腦缺血的一類(lèi)新藥，國(guó)外對(duì)該藥的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)內(nèi)馮亦璞等對(duì)丁苯酞治療腦缺血的相關(guān)機(jī)制做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有多靶點(diǎn)抗腦缺血作用，能改善線粒體功能，提高腦血管內(nèi)皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸釋放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和花生四烯酸含量，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，減輕腦缺血所致腦水腫，抗血栓形成和抗血小板聚集，縮小腦梗死面積

3、，改善局部腦血流量和細(xì)胞能量代謝、神經(jīng)功能缺失及腦缺血記憶障礙。作為一種抗腦缺血新藥，丁苯酞已廣泛應(yīng)用于腦血管病的治療，但該藥對(duì)VD的實(shí)驗(yàn)研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 基于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立VD模型及觀察其海馬形態(tài)，觀測(cè)海馬CHAT的變化，探討VD發(fā)病的膽堿能機(jī)制及丁苯酞改善腦缺血，提高VD小鼠學(xué)習(xí)、記憶的膽堿能藥理機(jī)制。 方法： 1.采用三次雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，造成腦組織反復(fù)缺血/再灌注，建立了小鼠VD模型，建立假手術(shù)組

4、排除手術(shù)本身對(duì)小鼠的影響，通過(guò)跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷富試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)測(cè)試，觀察其行為學(xué)改變；用HE染色觀察海馬病理學(xué)特征變化。 2.快速斷頭取腦，4％多聚甲醛溶液固定小鼠腦組織，用免疫組化在光鏡下觀察各組小鼠海馬組織CHAT的表達(dá)變化，并且計(jì)算其海馬CA1區(qū)CHAT陽(yáng)性細(xì)胞的面密度值，比較各組海馬的表達(dá)是否差異。 結(jié)果： 1.VD小鼠模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)及海馬病理學(xué)特征2 月齡雄性昆明小鼠56只，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組

5、、VD模型組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，連續(xù)三次腦缺血(20 min)再灌注(10min)，建立VD小鼠模型。術(shù)后29d，各組分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)及水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)試學(xué)習(xí)成績(jī)；術(shù)后30d測(cè)試記憶成績(jī)。然后用HE染色觀察各組小鼠海馬組織病理學(xué)特征。 1.1 學(xué)習(xí)成績(jī)術(shù)后第29天，分別進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī)，水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)

6、間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/3 min)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與假手術(shù)對(duì)照組的反應(yīng)時(shí)間(48.76±9.24)s比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(89.41±12.08)s明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2)與VD模型組的反應(yīng)時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時(shí)間(59.68±10.27)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的的反應(yīng)時(shí)間(57.23±10.05)s均明顯縮短(P<0.01)；(3)

7、與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(1.23±0.27)比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(3.74±0.42)明顯增加(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.52±0.38)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.48±0.31)均明顯減少(P<0.01)；(5)假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組之間的學(xué)習(xí)成績(jī)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1

8、)與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(87.32±13.46)s比較，VD模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(145.80±13.29)s明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2)與VD模型組的游全程時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(101.89±18.38)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的游全程時(shí)間(99.18±11.25)s明顯縮短(P<0.01)；(3)與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(16.88±4.19)比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(

9、34.60±5.92)明顯增多(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(18.71±4.35)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠學(xué)習(xí)階段的錯(cuò)誤次數(shù)(17.29±4.82)明顯減少(P<0.01)；(5)假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組的學(xué)習(xí)成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示VD模型小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其學(xué)習(xí)成績(jī)。 1.2記憶成績(jī)術(shù)后第30天，分別進(jìn)行跳臺(tái)

10、試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)，測(cè)試跳臺(tái)試驗(yàn)潛伏時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/5min)作為記憶成績(jī)，水迷宮試驗(yàn)游完全程時(shí)間(sec)和錯(cuò)誤次數(shù)(number/3min)作為記憶成績(jī)。 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與假手術(shù)對(duì)照組的潛伏時(shí)間(148.92±20.83)s比較，VD模型組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(78.67±19.17)s明顯縮短(P<0.01)；(2)與VD模型組的潛伏時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的潛伏時(shí)間(131.4

11、1±18.82)s及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的潛伏時(shí)間(128.57±18.29)s均明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(3)與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(0.32±0.05)比較，VD模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(1.72±0.13)明顯增加(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(0.54±0.08)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的的錯(cuò)誤次數(shù)(0.50±0.07)均明顯減少(P<0.01)；(

12、5)假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞預(yù)防治療組、丁苯酞治療組之間的記憶成績(jī)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其記憶成績(jī)。水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與假手術(shù)對(duì)照組的游全程時(shí)間(67.82±8.79)比較，VD模型組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(137.40±11.86)明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；(2)與VD模型組的游全程時(shí)間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的游全程時(shí)間(88.73±9.53)及丁苯酞預(yù)防治療組小

13、鼠記憶階段的游全程時(shí)間(83.87±8.62)明顯縮短(P<0.01)；(3)與假手術(shù)對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)(9.57±2.91)比較，模型組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(20.90±4.25)明顯增多。(P<0.01)；(4)與VD模型繾的錯(cuò)誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(11.17±3.04)及丁苯酞預(yù)防治療組小鼠記憶階段的錯(cuò)誤次數(shù)(10.27±2.83)明顯減少(P<0.01)；(5)假手術(shù)對(duì)照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療

14、組的記憶成績(jī)之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 以上結(jié)果提示VD模型小鼠的記憶成績(jī)降低，丁苯酞可以改善其記憶成績(jī)。 1.3 VD小鼠海馬病理學(xué)改變?cè)诠忡R下，(1)假手術(shù)對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體纓胞核大而圓，核仁明顯，細(xì)胞排列較致密整齊。(2)相比之下，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；部分細(xì)胞旁有空染區(qū)，核固縮、胞質(zhì)濃染、胞體變小，并且有膠質(zhì)細(xì)胞增生形成結(jié)節(jié)。(3)丁苯酞治

15、療組和預(yù)防治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，核固縮現(xiàn)象較少見(jiàn)。 2.VD小鼠海馬CA1區(qū)CHAT表達(dá)水平及丁苯酞的影響2.1 CHAT免疫組化染色小鼠10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，冠狀切片，采用SP法行免疫組化染色，觀察CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的變化。結(jié)果顯示：(1)與假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值為：(0.1178±0.0104)比較，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)CHA

16、T陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(0.0823±0.0236)明顯減少(P<0.05)；(2)與VD模型組比較，丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(0.1097±0.0131)和丁苯酞預(yù)防組小鼠海馬CA1區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元面密度值(0.1116±0.0135)明顯增多(P<0.05)；(3)丁苯酞治療組、丁苯酞預(yù)防治療組、假手術(shù)對(duì)照組海馬CA1區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元面密度之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA

17、1區(qū)GHAT水平降低參與了VD的發(fā)病機(jī)制，丁苯酞和丁苯酞預(yù)防治療組可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)CHAT水平表達(dá)下降而促進(jìn)其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的改善。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)建立的VD小鼠模型可模擬人類(lèi)VD以學(xué)習(xí)和記憶能力缺損為主的認(rèn)知功能障礙，是研究VD比較理想的動(dòng)物模型，對(duì)深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)病理性變化。 2.VD小鼠海馬CHAT蛋白表達(dá)水平降低，與其學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)下降相一致，提示CHAT