紅掌炭疽病病原的鑒定、分子檢測及群體遺傳多樣性研究.pdf

1、本文采用形態(tài)學和分子生物學兩種方法對紅掌炭疽病的病原進行了鑒定；并對紅掌炭疽菌的分子檢測進行了研究；同時建立了毀滅炭疽菌的RAPD-PCR和ISSR-PCR的最佳反應體系，對紅掌上的5個毀滅炭疽菌地理群體和1個膠孢炭疽菌地理群體進行了RAPD和ISSR分析。 紅掌炭疽菌的收集與鑒定：從廣州、揚州、南京等地采集紅掌炭疽菌，在經(jīng)單孢分離得到的炭疽菌中，存在形態(tài)差異明顯的兩個群體。每個群體各選取2個代表菌株，進行形態(tài)特征，致病性，寄主

2、范圍鑒定及核糖體DNA-ITS序列分析。結(jié)果表明：紅掌上有兩種致病菌，膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和毀滅炭疽菌(Colletotrichum destructivum)，后者是首次報道在紅掌上致病，且發(fā)現(xiàn)為優(yōu)勢種；兩者可單獨侵染，也可復合侵染，都具有潛伏侵染的特性。 紅掌炭疽菌的分子檢測：根據(jù)Colletotrichum 33個種的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITs)序列差異設(shè)計的兩對種特異性

3、引物E1/E2，F(xiàn)1/ITS4，可以分別特異地從紅掌上的膠孢炭疽菌和毀滅炭疽菌菌株中擴增到一條329 bp和486 bp的條帶，而從其它供試菌株中不能擴增出該條帶。這兩個檢測體系對純基因組DNA的擴增靈敏度均達到10pg；將這兩對引物分別與ITS區(qū)通用引物進行套式PCR后檢測靈敏度菌均至少可提高10000倍；當1g土中達到200個分生孢子均可被檢測出；進一步利用這兩個檢測體系對攜帶病原菌的灌溉水、發(fā)病組織進行檢測，均能快速穩(wěn)定地檢測出病

4、原菌。 毀滅炭疽菌基因組RAPD，ISSR-PCR體系的建立：對影響PCR反應的主要因子：Mg<'2+>、dNTP、Taq酶、引物濃度進行優(yōu)化，建立起適合于毀滅炭疽菌基因組DNA的RAPD和ISSR反應體系。RAPD反應體系(25μl)：Mg<'2+>濃度2.5mmol/L，dNTP濃度200μmol/L，Taq酶用量1U，引物濃度1μmol/L。ISSR反應體系(25μl)為：Mg<'2+>濃度2mmol/L，dNTP濃度15

5、0μmol/L，Taq酶用量0.5U，引物濃度1.25μmol/L。 炭疽菌基因組RAPD和ISSR指紋圖譜分析：采用RAPD和ISSR分析技術(shù)對來自于廣州、南京等地紅掌上的五個毀滅炭疽菌地理群體和來自廣州紅掌上的一個膠孢炭疽菌地理群體的DNA指紋圖譜進行了分析。結(jié)果表明：11條RAPD引物共擴增出155條條帶，其中多態(tài)性條帶比例為96.13％而10條ISSR引物擴增出101條條帶，多態(tài)性條帶比例為98.02％。無論是RAPD還