體外氣道感染模型的建立及四維成像技術(shù)在巨噬細胞跨膜遷移和吞噬研究中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　肺部感染是呼吸系統(tǒng)最常見的疾病。病原菌除了直接損傷機體引起疾病外，還可能引起其他疾病的發(fā)生，如有研究就認為支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展可能與金黃色葡萄球菌有關(guān)。粘附于氣道表面粘液層的病原菌大部分通過咳嗽咳痰予以清除。氣道及肺泡巨噬細胞是肺部主要的吞噬細胞，他們能清除定植于肺泡和氣道表面的少量細菌及外源性灰塵顆粒。當(dāng)大量的病原菌感染氣道時，中性粒細胞及單核細胞轉(zhuǎn)化而來的巨噬細胞便被招募到感染部位以清除病原菌。招募的單核巨噬細

2、胞通過氣道粘膜屏障（上皮細胞基底膜和上皮細胞層）而到達氣道表面,目前這一過程還缺少動態(tài)形態(tài)學(xué)資料的支持。獲取這種細胞活動的動態(tài)學(xué)資料的最佳方法是在活體動物上直接動態(tài)觀察細胞的活動。然而，立體動態(tài)的細胞活動在活體動物身上獲取是非常困難的。因此，模擬組織的體外細胞培養(yǎng)模型就顯得尤為重要。但是單一的細胞層及多細胞層的靜態(tài)研究無法用于巨噬細胞跨膜遷移的研究。因此我們將多細胞層的三維培養(yǎng)技術(shù)和激光共聚焦活細胞動態(tài)成像結(jié)合起來，用來研究氣道感染模型

3、中巨噬細胞的跨膜遷移及對金葡菌的清除。
　　研究目的：
　　1.建立模擬氣道感染的體外多細胞層三維培養(yǎng)模型，在體外模擬肺內(nèi)部環(huán)境，更直觀精確的觀察細胞和細胞間相互作用以及信號通路的關(guān)系。
　　2.將多細胞層三維培養(yǎng)技術(shù)和激光共聚焦活細胞動態(tài)成像結(jié)合起來形成四維成像技術(shù)，并用四維成像技術(shù)研究氣道感染模型中巨噬細胞的跨膜遷移及對金葡菌的清除。
　　研究方法：
　　1.巨噬細胞的分離及純化；
　　1％淀粉溶

4、液1ml連續(xù)腹腔注射小鼠3天，第五天對小鼠進行腹腔灌洗并對灌洗液進行離心洗滌后，并用貼壁法對巨噬細胞進行純化。
　　2.體外氣道感染模型的建立；
　　將LLC細胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，五天后待其形成完整細胞層后，將巨噬細胞種植于PET膜的下層，最后將金葡菌種植于LLC細胞層上。
　　3.跨膜電阻的測量；
　　將LLC細胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，并分別于第五天、第六天及加入金葡菌后第1、2、3

5、、4、5、6小時用電壓電阻儀測量LLC細胞層兩側(cè)的電阻。
　　4.巨噬細胞跨膜遷移運動的激光共聚焦顯微鏡實時成像:
　　氣道感染模型建立后并用紅色熒光染料標記LLC細胞，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細胞皿，于激光共聚焦顯微鏡上進行在Z軸（三維）及T軸（時間序列）成像。
　　5.金葡菌或MCP-1對巨噬細胞跨膜遷移的影響評估；
　　建立加金葡菌或MCP-1的實驗組氣道模型和無金葡菌的對照組氣道模型，并在加入金葡菌/MCP

6、-16小時后于激光共聚焦顯微鏡上三維成像并計算穿膜率。
　　6. ELISA檢測MCP-1水平；
　　將LLC細胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，第五天實驗組加入108級金葡菌于插入式培養(yǎng)皿的上室。3小時后收集實驗組和對照組（無金葡菌）的上室及下室的培養(yǎng)基。ELISA檢測實培養(yǎng)基中MCP-1的水平。
　　7.逆向跨膜遷移的激光共聚焦顯微鏡實時成像；
　　將LLC細胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，第五天加入巨

7、噬細胞于插入式培養(yǎng)皿的上室，并在插入式培養(yǎng)皿的下室加入小鼠重組 MCP-1。將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細胞皿于激光共聚焦顯微鏡上進行在Z軸（三維）及T軸（時間序列）成像。
　　8.巨噬細胞在氣道感染模型中吞噬金葡菌的激光共聚焦顯微鏡實時成像；
　　氣道感染模型建立后并用藍色熒光染料標記 LLC細胞及紅色熒光染料標記金葡菌，將培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至玻璃底細胞皿，于激光共聚焦顯微鏡上進行在Z軸（三維）及T軸（時間序列）成像。
　　9.

8、統(tǒng)計學(xué)方法
　　統(tǒng)計使用SPSS13.0軟件；數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示；巨噬細胞的高度用單側(cè)t’檢驗，其他用兩組間的獨立t檢驗；P＜0.05表示差異有顯著性。
　　研究結(jié)果：
　　1. LLC細胞形成完整細胞層；
　　將0.5 x106個LLC細胞種植于插入式培養(yǎng)皿PET膜的上層，胞數(shù)從24時的1061±97個/mm2逐步增加到120小時的4954±256個/mm2。細胞覆蓋的表面積從24小時的27.3±6.0%，

9、逐步增加到120小時的99.8±0.3%。LLC細胞基本能形成完整的單細胞層的時間大約為5天。
　　2.金葡菌對LLC細胞層的完整性無明顯影響；
　　我們檢測了加入金葡菌前后插入式培養(yǎng)皿PET膜兩側(cè)的跨上皮電阻抗的變化。我們發(fā)現(xiàn)加入金葡菌后6小時內(nèi)，無論107級和108級的金葡菌對跨上皮電阻均無明顯影響。
　　3.動態(tài)觀察氣道感染模型中巨噬細胞的跨膜遷移；
　　氣道感染模型建立后通過激光共聚焦四維成像及 IMAR

10、IS軟件三維重建，其結(jié)果顯示巨噬細胞通過PET膜上的小孔遷移至培養(yǎng)體系的上室。
　　4.培養(yǎng)體系中加入金葡菌增加了巨噬細胞的跨膜遷移；
　　通過激光共聚焦四維成像及 IMARIS7.0.三維重建，發(fā)現(xiàn)一些巨噬細胞可以通過PET膜上的小孔遷移到插入式培養(yǎng)皿的上層；感染模型組中巨噬細胞的穿膜率顯著高于對照組。
　　5.培養(yǎng)體系中加入金葡菌增加了MCP-1趨化因子的表達；
　　我們檢測了加入金葡菌的實驗組和無金葡菌的對

11、照組中MCP-1的水平差異。在實驗組加入金葡菌3小時后，實驗組的MCP-1水平明顯高于對照組。
　　6.培養(yǎng)體系中加入小鼠重組MCP-1增加了巨噬細胞的跨膜遷移；
　　將重組的小鼠MCP-120ng/ml加入實驗組的插入式培養(yǎng)皿的上室。六小時過后，實驗組的巨噬細胞穿膜率遠遠高于對照組。
　　7.培養(yǎng)體系中加入金葡菌影響巨噬細胞在上皮細胞層中的運動方式；
　　通過激光共聚焦四維成像及 IMARIS7.0.三維重建和

12、巨噬細胞示蹤，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在插入式培養(yǎng)皿上層主要有三種運動方式。與不加金葡菌的對照組相比，培養(yǎng)體系中加入金葡菌對巨噬細胞的運動方式有影響。另外，在未加入金葡菌的對照組，沒有發(fā)現(xiàn)巨噬細胞穿過LLC單層細胞層并到達LLC單層細胞層的表面。
　　8.巨噬細胞從上向下跨膜遷移的動態(tài)觀察；
　　氣道感染模型的四維成像顯示有巨噬細胞從上層通過PET膜遷移到培養(yǎng)體系的下層。將巨噬細胞種植在LLC單細胞層的表面，并且加入20ng/ml的

13、小鼠重組MCP-1于培養(yǎng)體系的下層，有更多的巨噬細胞從培養(yǎng)體系上層遷移到下層。
　　9.巨噬細胞在氣道感染模型中對金葡菌的吞噬具有時間依賴性；
　　氣道感染模型的四維成像顯示，定植于LLC單細胞層表面的金葡菌粘附于露出于LLC單細胞層的巨噬細胞，隨后巨噬細胞被吞噬。隨著時間的推移，越來越多的巨噬細胞吞噬了金葡菌，平均每個巨噬細胞也吞噬了越來越多的金葡菌。
　　研究結(jié)論：
　　1.依據(jù)氣道感染時的病理結(jié)構(gòu)，我們成功