肝癌患者CD4+CD25+CD127low--CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤相關(guān)死亡率中位居第三位。我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，約占全球肝癌病例一半以上。肝癌嚴(yán)重影響我國人民的健康事業(yè)，并帶來了巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。由于肝癌早期診斷較難，患者就診時(shí)往往已屬晚期。雖然近來手術(shù)切除、肝移植、射頻消融、肝動(dòng)脈栓塞化療和分子靶向治療等手段對(duì)肝癌的治療取得了很大的進(jìn)步，但總體上術(shù)后高復(fù)發(fā)率和高死亡率近來未有明顯改善。免疫治療作為

2、腫瘤最有希望的治療手段越來越受到重視。同時(shí)肝臟作為免疫特惠器官又是免疫治療理想的靶器官。既往對(duì)肝癌的研究集中在肝癌細(xì)胞本身的生物學(xué)行為上，忽略了肝癌演進(jìn)過程中肝癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)中各種免疫細(xì)胞之間的相互作用，而后者被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)展、侵襲中發(fā)揮重要的作用。具有免疫抑制性作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在腫瘤細(xì)胞逃避局部微環(huán)境的免疫監(jiān)視從而發(fā)生免疫逃逸的過程

3、中，扮演著重要的角色。
　　 本研究從腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志入手，證實(shí)了在免疫微環(huán)境中CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)和表達(dá)，表現(xiàn)為更強(qiáng)的免疫抑制表型，并與肝癌的臨床病理特征相關(guān)。進(jìn)而我們通過全基因芯片篩選出較重要的調(diào)控腫瘤浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能相關(guān)的功能基因，分析腫瘤浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用的免疫信號(hào)通路?；谀匦酒瑱z測(cè)HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜特

4、征性的聚糖改變。最后通過對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與galectin-1在HCC中表達(dá)的相關(guān)性分析，為HCC預(yù)后的預(yù)測(cè)和免疫治療提供新的選擇。
　　 第一部分HCC患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)和表型研究
　　 本部分研究旨在探索CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在HCC患者體內(nèi)不同部位(外周血、癌旁肝臟和癌灶)的分布和表達(dá)。
　　 我們通過梯度離心結(jié)合酶

5、消化法，建立了穩(wěn)定的獲取外周血、組織內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分離方法。借助于流式細(xì)胞儀，首次采用四色熒光分選淋巴細(xì)胞，配對(duì)比較分析了三處不同來源的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分布表達(dá)和表型。發(fā)現(xiàn)在。HCC患者外周血、癌旁肝組織和癌灶中，CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分布和免疫表型截然不同。首先，HCC患者腫瘤微環(huán)境中存在高表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+CD127low/-C

6、D49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。其次，HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占整個(gè)CD4+T細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照者。HCC患者腫瘤浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占整個(gè)CD4+T細(xì)胞比例顯著高于配對(duì)的癌旁肝組織和外周血。最后，HCC患者癌灶浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)較高的免疫抑制表型，如FoxP3、CTLA-4和GITR?；旌狭馨图?xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)活化分子CD154的抑制率較對(duì)照明顯增強(qiáng)，表明具有較強(qiáng)的免疫抑制能力

7、。結(jié)合體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這群淋巴細(xì)胞分泌高水平的免疫抑制因子IL-10和TGF-β1，擴(kuò)增后的細(xì)胞仍保持較高的抑制表型。我們分選出的腫瘤浸潤(rùn)的這群具有抑制能力的淋巴細(xì)胞較癌旁肝組織和外周血來源的顯示出更強(qiáng)的免疫抑制能力。
　　 我們首次采用四色熒光分選出的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴細(xì)胞高表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志FoxP3，較其他相關(guān)研究文獻(xiàn)可獲得更高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并且這群高表達(dá)FoxP3的

8、T淋巴細(xì)胞保持活性狀態(tài)，可用于下游的功能實(shí)驗(yàn)。CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T細(xì)胞高表達(dá)于肝癌腫瘤微環(huán)境中，表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫抑制表型，體現(xiàn)了腫瘤免疫微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能，參與HCC的腫瘤生物學(xué)進(jìn)程。
　　 第二部分基于全基因芯片的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞基因表達(dá)譜分析
　　 結(jié)合前部分研究結(jié)果和其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們可以認(rèn)為癌灶浸潤(rùn)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之所

9、以表達(dá)增強(qiáng)的抑制表型，必然是受到腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的影響，導(dǎo)致其與免疫抑制功能相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)和信號(hào)通路激活。但具體參與的調(diào)控基因和信號(hào)通路尚未有系統(tǒng)的報(bào)道。在本部分研究中，我們利用Agilent全基因芯片對(duì)9例HCC患者配對(duì)的癌灶和癌旁肝組織中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行全基因表達(dá)譜的對(duì)比分析，以期找出與免疫抑制功能相關(guān)的關(guān)鍵差異基因及相應(yīng)的信號(hào)通路。
　　 我們利用酶消化法和梯度離心法分離出癌灶和癌旁肝組織浸潤(rùn)淋巴細(xì)

10、胞，再利用流式細(xì)胞儀分選CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。細(xì)胞RNA抽提后與Agilent全基因芯片雜交，GenePix4000B芯片掃描儀掃描分析結(jié)果。結(jié)果顯示Hierarchical聚類分析樣本劃分不同組別明顯。將標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為Fold Change≥2，P＜0.05后，癌灶浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相對(duì)于癌旁肝組織浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共有1032個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1357個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。PATHWAY結(jié)果顯示兩組間有7條上

11、調(diào)通路和9條下調(diào)通路差異。GO分析顯示癌灶浸潤(rùn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相對(duì)于癌旁肝組織調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有431條GO條目上調(diào)，237條GO條目下調(diào)。我們選取與腫瘤免疫和T細(xì)胞免疫相關(guān)的GO條目并按照Fold Change大小，從前15條中選取基因CD46、BCL6、TNFRSF11A、MDM4、P2RX7、CD276和IL6R進(jìn)行分析，并對(duì)選取的基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。
　　 其中高表達(dá)RANK(TNFRSF11A基因編碼)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與高

12、表達(dá)RANKL的HCC腫瘤細(xì)胞之間的RANK-RANKL信號(hào)通路，高表達(dá)IL-6R的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與高表達(dá)IL-6的HCC腫瘤細(xì)胞之間的IL6-IL-6R信號(hào)通路在HCC腫瘤免疫逃逸中可能起到很重要的作用。
　　 第三部分凝集素芯片檢測(cè)CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和Hep3B特征性糖基化改變
　　 腫瘤特征性糖基化改變影響著腫瘤細(xì)胞的

13、惡性生物學(xué)行為。同樣，異常的糖基化改變也影響著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。目前，糖生物方興未艾，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)新的領(lǐng)域。腫瘤細(xì)胞異常的糖基化改變已證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控糖基化改變。現(xiàn)已證實(shí)糖基化改變?cè)诹馨图?xì)胞的成熟，陰性陽性分化選擇，歸巢，凋亡等過程中起著非常重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能也必然伴隨著糖基化的改變而改變。凝集素是一種可以與特定糖鏈結(jié)合的糖蛋白，利用此特性可以檢測(cè)出特定糖鏈的表達(dá)和改變。國內(nèi)目

14、前尚未廣泛開展基于凝集素芯片的肝癌相關(guān)研究。
　　 我們已于前期成功構(gòu)建檢測(cè)糖基化改變的凝集素芯片，并檢測(cè)出不同來源的甲胎蛋白之間細(xì)微的聚糖改變，為我們這部分的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。本部分實(shí)驗(yàn)首先在前期的基礎(chǔ)上擴(kuò)大凝集素芯片上凝集素的種類至32種，以便能夠更準(zhǔn)確地捕捉糖鏈的改變。我們構(gòu)建的對(duì)細(xì)胞膜表面糖鏈可進(jìn)行即時(shí)、高通量檢測(cè)的凝集素芯片，優(yōu)點(diǎn)在于將凝集素與芯片技術(shù)相結(jié)合，利用芯片高通量、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)提取的膜蛋白糖鏈進(jìn)

15、行自動(dòng)捕獲，成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜表面糖鏈進(jìn)行高通量的檢測(cè)分析，獲得細(xì)胞膜表面糖鏈全面而綜合的信息。甘露糖抑制實(shí)驗(yàn)和胎球蛋白實(shí)驗(yàn)充分顯示我們構(gòu)建的凝集素芯片具有糖鏈結(jié)合的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。最后我們將分選的HCC患者與健康志愿者的外周血CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞提取細(xì)胞膜蛋白后與芯片雜交后發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較健康對(duì)照的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜表面α1-6巖藻糖、α1-6甘露糖、GalNac、

16、β型半乳糖鏈、復(fù)雜型N-聚糖增加。另外，我們選取轉(zhuǎn)移潛能梯度降低的人肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和幾乎不轉(zhuǎn)移的Hep3B，經(jīng)細(xì)胞膜蛋白提取和Trizol提取RNA后，分別與凝集素芯片和糖基轉(zhuǎn)移酶PCR芯片雜交。結(jié)果提示，HCCLM3相對(duì)于Hep3B，代表唾液酸糖鏈的MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA明顯增加；代表甘露糖鏈的ConA和GNA明顯增加；代表巖藻糖鏈的LTL、LCA、PSA和UEA-1明顯增加；代表半乳糖

17、鏈的BPL、EEL、jacalin，GSL-1增加；代表GlcNAc的PHA-L增加；代表GalNAc的VVA、DBA、SBA明顯增加。糖基轉(zhuǎn)移酶PCR芯片結(jié)果提示HCCLM3較Hep3B，ST3Gal1、FUT8和MGAT5等轉(zhuǎn)移酶增高。其中MAL-Ⅰ，MAL-Ⅱ和WGA變化相對(duì)于ST3Gal1，PSA、LCA相對(duì)于FUT8，PHA-L相對(duì)于MGAT5。
　　 因此我們可以認(rèn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性糖基化改變可能伴隨著免疫功能的變

18、化。HCC細(xì)胞的特征性糖基化改變及相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶改變?yōu)槟[瘤的治療從糖生物學(xué)的角度提供了新的方向。
　　 第四部分Galectin-1對(duì)HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響及與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)性的研究
　　 異常的糖基化改變影響著腫瘤的惡性生物學(xué)行為。Galectin-1是半乳凝素家族重要成員之一，通過與腫瘤細(xì)胞表面聚糖(glycan)形成galectin-glycan結(jié)構(gòu)參與調(diào)控腫瘤的分化、遷移、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。在許多腫瘤

19、中都發(fā)現(xiàn)galectin-1表達(dá)的增高與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。許多高表達(dá)galectin-1的腫瘤都提示不良預(yù)后。近來研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的過程中受到腫瘤細(xì)胞來源的galectin-1的信號(hào)調(diào)控。同時(shí)，我們前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示HCC患者外周血Treg膜表面表達(dá)較高的半乳糖鏈。目前在HCC中尚未有關(guān)galectin-1和Treg的表達(dá)及相關(guān)性的報(bào)道。
　　 在本部分研究中我們通過免疫組化的方法，對(duì)包含3

20、86例HCC患者的組織芯片檢測(cè)FoxP3+Treg和galectin-1的表達(dá)，并通過生存分析觀察galectin-1與預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)通過流式細(xì)胞儀和ELISA分別檢測(cè)31例HCC患者的外周血中的CD4+CD25+FoxP3+Treg和galectin-1的表達(dá)，以期發(fā)現(xiàn)兩者在組織和外周血之間的相關(guān)性。最后我們利用ELISA法驗(yàn)證了147例HCC患者血清中g(shù)alectin-1的表達(dá)水平。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-1在HCC腫瘤組織

21、中高表達(dá)，是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。高表達(dá)galectin-1的HCC患者預(yù)后較差。Galectin-1與HCC的臨床病理特征相關(guān)，如腫瘤大小、包膜是否完整和血管侵犯等等。在BCLC早期的HCC患者中，galectin-1也顯示出預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值。肝癌組織中Galectin-1的表達(dá)與FoxP3+Treg數(shù)量?jī)烧叱收嚓P(guān)，但是在外周血中兩者的表達(dá)無相關(guān)性。
　　 我們的結(jié)果提示腫瘤微環(huán)境中的galectin-1可能促進(jìn)Treg在HCC中擴(kuò)

22、增，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展和預(yù)后，為腫瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 結(jié)論
　　 1.CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴細(xì)胞高表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志FoxP3。
　　 2.腫瘤浸潤(rùn)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過IL6R/IL6、RANK/RANKL信號(hào)通路參與HCC腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。
　　 3.HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較健康對(duì)照的外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜表面α1-6巖藻糖、α1-6甘

23、露糖、GalNac、β型半乳糖鏈、復(fù)雜型N-聚糖增加。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性糖基化的改變可能伴隨著細(xì)胞免疫抑制功能的變化。
　　 4.肝癌細(xì)胞具有α2-3，α2-6唾液酸、巖藻糖、平分型GlcNAc等糖鏈表達(dá)上調(diào)，可能受糖基轉(zhuǎn)移酶ST6GALNAC1、ST3Gal1、FUT8和MGAT5等調(diào)控。
　　 5.Galectin-1在HCC中的高表達(dá)伴隨著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的增加，聯(lián)合調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和galectin-1可增加預(yù)測(cè)HC

24、C患者預(yù)后的準(zhǔn)確性?？勺鳛镠CC免疫治療的靶點(diǎn)。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.首次在HCC患者中分選出具有活性的可供功能實(shí)驗(yàn)所需的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
　　 2.首次提出IL6R/IL6、RANK/RANKL信號(hào)通路可能參與HCC腫瘤浸潤(rùn)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸。
　　 3.HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特征性糖基化的改變可能伴隨著細(xì)胞免疫抑制功能的變化。